水貂和貉Toll样受体基因的克隆及表达分析和貉外周血单个核细胞转录组学研究

摘要

近年来，随着毛皮动物饲养业的发展、饲养管理不当和抗病力下降等原因，致使毛皮动物疫病在有些地区爆发，导致毛皮动物大规模的死亡。因此，深入了解并研究毛皮动物免疫防御机制，寻找提高机体抗病能力的有效方法，同时培育抗病品系，是毛皮动物养殖业健康发展的必驱之势。
　　本研究以雪貂TLRs基因为参考序列设计四对引物，从水貂PBMCs中扩增TLR4、TLR6、TLR7及TLR8部分基因，分别进行分子克隆并对所得序列进行生物信息学分析，进一步利用半定量RT-PCR技术分析TLR4和TLR7基因mRNA在不同年龄水貂的各组织（肝脏、肺脏、肌肉、肾脏、小肠、脾脏）及PBMCs中的表达情况。结果表明，水貂TLRs与食肉目动物（雪貂、北极熊、大熊猫、海象、海豹、犬、老虎、猫）具有较高的同源性，在系统发育树中距离最近;与禽类、鱼同源性较低;TLR7基因在不同物种间具有较高的保守性，而TLR4基因的保守性最低。组织表达分析表明，TLR4和TLR7在检测的组织中广泛表达且表达量存在差异，相比成年水貂，仔貂各组织中TLR4和TLR7基因表达量更高。
　　本研究系国内首次利用RT-PCR和RACE技术，以犬TLR8基因为参考序列设计引物，克隆了貉TLR8基因全长序列，应用生物信息学软件分析该基因及预期编码蛋白的特征。结果显示该基因全长3199bp，ORF全长3114bp，编码1038个氨基酸，含有Toll样受体家族典型的结构域特征。同源性分析显示貉TLR8基因核苷酸序列与犬同源性最高，达99.3％;与其他食肉目哺乳动物也有较高的同源性，在89.2％-92.9％之间:与鱼类同源性最低，亲缘关系最远。
　　采用二代测序技术，对貉PBMCs转录组进行了RNA-Seq测序、de novo拼接和信息比对研究。结果表明:转录组测序共得到了3.1GB的原始数据，共32245804个读长，去除载体信息的数据量为28797350个读长。经质量控制和de novo拼接后，对组装出来的转录本利用TransDecoder鉴定coding区域，共获得了118868条貉转录本，其平均长度为525.53bp。利用Trinotate对ORF和contigs进行功能注释，用Uniprot database、RNAMMER、eggNOG、GO、KEGG对预测出来的序列进行注释，其中，COG功能注释中信号转导机制(T)及防御机理(V)，KEGG注释通路中B/T-细胞受体信号通路、TLR/NLR/ RIR受体信号通路、吞噬体通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路均与貉免疫应答与抗病相关。
　　通过对水貂TLR4、TLR6、TLR7及TLR8基因部分序列的测定、生物学特征的分析和组织分布情况的研究，及对貉TLR8基因全长序列的克隆测序、预期编码蛋白特征的分析，来探讨毛皮动物（水貂、貉）重要的免疫分子及其免疫机制，进一步通过二代测序技术，对貉PBMCs的转录组进行了RNA-Seq测序和信息比对研究，旨在为后续开展毛皮动物的疫病防控及其免疫机制研究提供重要的基础和参考，并为抗病育种积累可供选择的基因素材。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 模式识别受体及抗病毒天然免疫

1．1．1 细胞表面TLRs

1．1．2 细胞内TLRs

1．1．3 RLRs

1．1．4 炎性小体激活及白介素1(IL-1)

1．1．5 胞浆内识别病毒DNA诱导IFN-β

1．2 转录组学研究进展

1．2．1 转录组的概念与研究内容

1．2．2 转录组学的研究方法

1．2．3 表达序列标签技术(Expressed Sequence Tags，EST)

1．2．4 基因芯片技术(Genechip)

1．2．5 基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)

1．2．6 大规模平行测序技术(Massively parallel signature sequencing，MPSS)

1．2．7 RNA测序技术(RNA-Seq技术)

1．3 本研究目的及意义

第二章 水貂Toll样受体基因的分子克隆、序列分析及组织表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验动物

2．1．2 试验试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 引物设计及合成

2．1．5 外周血单个核细胞的提取

2．1．6 总RNA的提取

2．1．7 单链cDNA的合成

2．1．8 TLR4、TLR6、TLR7、TLR8基因片段的RT-PCR扩增

2．1．9 RT-PCR产物的克隆与重组质粒的序列测定

2．1．10 半定量RT-PCR检测健康仔貂和成年貂TLR4、TLR7基因的组织分布

2．2 结果与分析

2．2．1 PBMCs总RNA的提取

2．2．2 水貂TLR4、TLR6、TLR7、TLR8基因的PCR扩增

2．2．3 重组质粒的鉴定

2．2．4 水貂TLR4、TLR6、TLR7、TLR8基因的同源性分析

2．2．5 水貂TLR4、TLR6、TLR7、TLR8基因的进化树分析

2．2．6 TLR4、TLR7基因在健康仔貂和成年貂组织中的分布情况

2．3 讨论

第三章 貉TLR8全长基因的分子克隆及其结构与功能预测分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验动物

3．1．2 试验试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 引物合成

3．1．5 总RNA的提取和单链cDNA的合成

3．1．6 乌苏里貉TLR8基因全长序列克隆

3．1．7 乌苏里貉TLR8基因的生物信息学分析

3．2 结果与分析

3．2．1 PBMCs总RNA的提取

3．2．2 TLR8基因中间段序列PCR扩增及3’RACE和5’RACE扩增

3．2．3 TLR8全长基因的序列验证

3．2．4 TLR8全长基因编码蛋白的理化特性

3．2．5 乌苏里貉TLR8编码蛋白的二级结构分析

3．2．6 乌苏里貉TLR8蛋白的信号肽预测

3．2．7 乌苏里貉TLR8蛋白的跨膜区预测

3．2．8 乌苏里貉TLR8蛋白质结构域预测

3．2．9 乌苏里貉TLR8基因与其他物种TLR8基因同源性分析

3．3 讨论

第四章 貉外周血单个核细胞转录组RNA-Seq测序及分析

4．1 材料与方法

4．1．1 试验动物及材料

4．1．2 试验试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 乌苏里貉外周血单个核细胞总RNA的提取

4．1．5 cDNA文库的构建和Illumina测序

4．1．6 质量控制和序列的拼接

4．1．7 转录物功能注释及分类

4．1．8 ORF预测

4．1．9 基因表达分析

4．2 结果与分析

4．2．1 总RNA质量检测

4．2．2 测序数据初步分析

4．2．3 转录物功能注释及分类

4．2．4 ORF预测及基因表达分析

4．2．5 本地BLAST数据库的建立及初步应用

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历