猪耳型性状全基因组关联分析及重要候选基因MSRB3的克隆分析

摘要

耳型是猪的重要品种特征之一，在品种鉴定中发挥重要作用。但是，目前对耳型基因定位研究较少，还未揭示其主效基因及因果突变位点。本研究利用Illumina的猪SNP60芯片，在大白猪×民猪F2资源群体中对耳型性状进行全基因组关联分析，对定位到的显著关联区间进行精细定位，并对重要候选基因MSRB3进行cDNA全序列克隆及分析。主要研究内容如下:
　　采用基于混合模型及回归的快速全基因组关联分析及基因组控制的方法，对F2资源群体的耳型性状进行全基因组关联分析，共检测到23个全基因组水平显著的SNPs(P＜1.0509×10-6)，将影响耳型性状的QTL定位到SSC5上位于30.31Mb和36.11Mb之间的长为5.80Mb的区域内，其中，最显著关联的SNP位点ASGA0025237位于WIF1内(P=2.39×10-7)。为了进一步缩小QTL区间，采用标记辅助分离分析、IBD分析及单倍型分析进行精细定位。最终将QTL定位到了标记ASGA0025237和ALGA0031527之间的639kb区间内，共包含WIF、LEMD3和MSRB3三个基因，可作为耳型性状的候选基因进行后续研究。
　　对大白猪耳样提取RNA后，采用PCR和RACE方法，克隆MSRB3 cDNA全序列，获得了全长为3765bp的cDNA全序列，提交GenBank，获得登录号:KP772260。该序列包含了189bp的5'-UTR、552bp的编码183个氨基酸的ORF区和3017bp的3'-UTR，由7个外显子组成，且在3'末端具有加尾信号AATAAA。该基因的cDNA序列和氨基酸序列与人、猩猩、鼠、鸡和斑马鱼分别进行比对分析，cDNA序列的一致性分别为84％、84％、87％、86％和70％，氨基酸序列的一致性分别为88％、91％、89％、86％和67％。利用SMART预测MSRB3蛋白的保守结构域，获得了一个由123个氨基酸组成的SelR结构域，可结合该蛋白催化活性所必须的锌原子。组织表达谱分析显示该基因在肌肉中相对表达量(0.699)最高，在淋巴中相对表达量(0.0019)最低，在耳朵中中等程度表达。利用4头祖代大白和4头祖代民猪检测MSRB3的外显子和启动子上的多态性，共检测到8个SNP位点。其中，c.2571T＞C位于3'-UTR，同义突变c.484T＞C位于ORF，其它位点c.-1750A＞T、c.-1674G＞A、c.-1586T＞C、c.-1573C＞A、c.-735C＞T和c.-358G＞A位于启动子内。c.-1750A＞T位于预测的启动子活性区域内。MSRB3的克隆分析为进一步开展其基因功能研究奠定了基础。
　　本研究通过GWAS和精细定位发现MSRB3基因可作为猪耳型性状主效候选基因之一，不但对GWAS后主效基因探索研究有着重要的理论意义，也为猪种质资源分子鉴定提供了辅助方法和参考借鉴。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 全基因组关联分析

1．1．1 全基因组关联分析的提出和概念

1．1．2 全基因组关联分析的优势

1．1．3 全基因组关联分析的基础

1．1．4 影响全基因组关联分析准确性的因素

1．1．5 全基因组关联分析应用进展

1．2 耳性状基因定位研究进展

1．2．1 人类耳性状基因定位研究进展

1．2．2 犬耳性状基因定位研究进展

1．2．3 猪耳性状基因定位研究进展

1．3 本研究的目的及意义

第二章 猪耳型性状全基因组关联分析

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 仪器设备、主要试剂及溶液的配制

2．2 试验方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 耳样采集及表型测定

2．2．3 基因组DNA的提取与检测

2．2．4 SNP基因型的判定

2．2．5 芯片数据质量控制

2．2．6 统计分析

2．2．7 标记辅助分离分析

2．2．8 IBD分析

2．2．9 单倍型分析

2．2．10 基因注释及候选基因筛选

2．3 试验结果

2．3．1 质量控制

2．3．2 全基因组关联分析

2．3．3 群体分层

2．3．4 标记辅助分离分析

2．3．5 IBD分析

2．3．6 单倍型分析

2．4 讨论

2．4．1 全基因组关联分析

2．4．2 精细定位

2．4．3 小结

第三章 猪耳型性状重要候选基因MSRB3的克隆分析

3．1 试验材料

3．1．1 试验动物

3．1．2 主要仪器、试剂和溶液配制

3．2 试验方法

3．2．1 样品采集

3．2．2 基因组DNA和总RNA的提取

3．2．3 反转录合成cDNA

3．2．4 MSRB3 cDNA全序列克隆

3．2．5 生物信息学分析

3．2．6 外显子顾序鉴定

3．2．7 组织表达谱分析

3．2．8 多态性探索及分析

3．3 试验结果

3．3．1 MSRB3 cDNA全序列克隆

3．3．2 外显子排列顺序鉴定

3．3．3 生物信息学分析

3．3．4 组织表达谱分析

3．3．5 多态性探索及分析

3．4 讨论

3．4．1 耳型性状重要候选基因MSRB3

3．4．2 MSRB3 cDNA全序列克隆

3．4．3 生物信息学分析

3．4．4 多态性探索及分析

3．5 小结

第四章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历