猪流行性腹泻病毒流行毒FJzz1/2011株对仔猪的致病性分析及N蛋白抗原表位的鉴定

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引起的仔猪出现严重腹泻乃至死亡的高度接触性肠道传染病。为了深入了解该病病原特征，我们以2011年分离自福建某发病猪场的PEDV流行毒FJzz1/2011株为研究对象，从病原学角度对其生物学特性进行研究。首先将FJzz1/2011株在Vero细胞中连续传代与纯化，结果显示:F1代及蚀斑纯化后F5、F10和F20代病毒感染后均能形成细胞融合和多核体细胞病变;对分离及纯化的各代次毒株进行RT-PCR检测，结果仅PEDV呈阳性，且各代次毒株均能被抗PEDV的抗体识别，表明我们获得的FJzz1/2011株不含有其他病毒，且在电镜下可以观察到周围有棒状突起的呈明显冠状病毒特征的病毒粒子形态。病毒增殖曲线结果显示，该毒株在感染后6-24h内增殖速率较快，24h可达到复制高峰。对流行毒FJzz1/2011株进行全基因测序，发现该毒株S基因存在较大变异，与经典毒株CV777相比，流行毒FJzz1/2011株存在6个氨基酸的插入（插入位置:59QGVN62、140N和157H）和2个连续氨基酸的缺失（缺失位置:163NI164）的特征性突变，经序列比较分析后，我们推测目前我国新流行的PEDV毒株可能来自于韩国。
　　为了深入了解新流行的PEDV分离毒株对仔猪的致病性特征，我们选取了15头3日龄的健康哺乳仔猪，分别以口服（A组）和肌注(B组）两种途径对其进行感染，攻毒剂量为1×104.0TCID50，实验结果显示:攻毒后A组和B组所有感染仔猪均表现出严重腹泻、呕吐、厌食和消瘦等临床症状，其中A组死亡率为80％，B组死亡率为100％;在整个试验期间内C组未出现异常表现。对感染后死亡仔猪组织脏器进行剖检观察，结果可见发病死亡仔猪小肠管壁变薄、肠内有大量淡黄色流动性稀便。组织病理学观察，显示，A组和B组感染发病仔猪的小肠肠绒毛出现严重萎缩与脱落;对攻毒后不同时间所采集的肛拭子及死亡仔猪的小肠内容物进行RT-PCR鉴别诊断，结果显示A组和B组的所有试验猪均呈PEDV阳性;对感染仔猪的小肠内容物中进行病毒分离，结果我们分别从A组和B组的样品中分离获得了PEDV毒株，经序列分析证实所分离获得的毒株与FJzz1/2011株S基因同源性高达100％。对仔猪的攻毒试验结果表明我们分离获得的PEDV流行毒FJzz1/2011株对哺乳仔猪具有较强的致病性。
　　PEDV的N蛋白具有较高的诊断价值，为了探究PEDV流行毒FJzz1/2011株N蛋白的抗原性，我们选取两株针对PEDV-N蛋白的特异性单抗PN-D6与PN-D4，分别以FJzz1/2011株为模板构建并融合表达其N蛋白及其分节段蛋白，利用表达蛋白为抗原，对2株抗N蛋白的单抗进行ELISA鉴定，结果显示单抗PN-D4可特异性识别截短的N1蛋白，单抗PN-D6可特异性识别截短的N2蛋白，对两株单抗识别的表位进行确切定位，结果证实单抗PN-D6所识别N蛋白的抗原表位为N252RSDSSGKNTPK262，而单抗PN-D4所识别N蛋白的抗原表位为18-133aa。分析发现两个抗原表位在不同的冠状病毒间特异性较强，在不同的PEDV毒株间则相对保守，表明我们获得的两株单抗可以作为PEDV的特异性诊断工具。通过上述研究，我们证实该毒株属于新流行的PEDV变异毒株，对哺乳仔猪具有较强的致病性;鉴定出两个针对该流行毒N蛋白单抗的抗原表位，对今后深入研究PEDV病毒变异对致病性的影响，了解PEDV的抗原特性，建立基于抗原表位水平的特异性诊断方法具有重要意义。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 PED的发生史

1．1．1 PEDV的发生与发展

1．1．2 PEDV的流行现状

1．2 PED的流行特点

1．2．1 传染与传播

1．2．2 临床症状

1．2．3 病原感染后的组织嗜性

1．2．4 组织病理变化

1．2．5 PEDV的感染特点

1．3 PEDV的病原学特征

1．3．1 PEDV病原学分类地位

1．3．2 PEDV生物与理化性质

1．3．3 PEDV的分离与培养特性

1．3．4 PEDV编码蛋白的结构与功能

1．3．5 PEDV与冠状病毒

1．4 PEDV的诊断与防控

1．4．1 诊断与鉴别诊断

1．4．2 PEDV的防控

1．4．3 其它防控措施

1．5 目的与意义

第二章 PEDV流行毒FJzz1／2011株对仔猪的致病性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 PEDV流行毒FJzz1／2011株的生物学特性分析

2．1．3 PEDV流行毒FJzz1／2011株对仔猪的致病性分析

2．2 结果

2．2．1 PEDV流行毒FJzz1／2011株的生物学特性

2．2．2 PEDV流行毒FJzz1／2011株对仔猪的致病性分析

2．3 讨论

第三章 PEDV流行毒FJzz1／2011株N蛋白抗原表位的鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 PEDV流行毒N蛋白的表达

3．1．3 PEDV-N蛋白抗原表位的筛选

3．1．4 单抗PN-D6抗原表位的鉴定

3．1．5 PN-D4对应抗原表位的鉴定

3．1．6 抗原表位EP-D4、EP-D6的Westem-Blot鉴定

3．1．7 PN-D6与PN-D4抗原表位分析

3．1．8 EP-D4及EP-D6的特异性检测

3．1．9 单抗PN-D6和PN-D4在病毒感染细胞中的定位

3．2 结果

3．2．1 PEDV-N、N1及N2蛋白的表达与鉴定

3．2．2 PEDV-N蛋白表位的筛选

3．2．3 PN-D6抗原表位的鉴定

3．2．4 PN-D4抗原表位的鉴定

3．2．5 EP-D4及EP-D6的Westem-Blot分析

3．2．6 PN-D6抗原表位的分析

3．2．7 PN-D4抗原表位的分析

3．2．8 EP-D4及EP-D6的特异性检测

3．2．9 PN-D6与PN-D4在病毒感染细胞中的定位

3．3 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历