酵母双杂交系统筛选猪流行性腹泻病毒N蛋白互作宿主蛋白及N蛋白抗原表位鉴定

摘要

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染猪小肠细胞致使细胞死亡脱落从而引起的急性传染病，主要临床症状是水样腹泻、呕吐，对7日龄以内哺乳仔猪尤为易感。自2010年以来，以变异PEDV为主要病原体的PED在我国爆发，并迅速席卷全国及周边亚洲国家，给养猪业带来巨大的经济损失。PEDV为典型的单股正链RNA冠状病毒，与其他冠状病毒一样具有四个结构蛋白分别为纤突（Spike，S）蛋白、膜（Membrane，M）蛋白、小膜蛋白（Envelope，E）和核衣壳（Nucleocapsid，N），其中N蛋白是一个重要的结构蛋白，并且高度保守，因此筛选PEDVN蛋白与宿主细胞的互作蛋白，以及筛选针对N蛋白抗原表位，对于探寻PEDV的致病机制和特异性新型疫苗研究等提供帮助。本实验研究内容及结果如下：
　　（1）为了获得与PEDV N蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究构建猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的重组载体pGBKT7-N，以其作为诱饵质粒，采用酵母双杂交方法，经过两次缺失培养基筛选，从猪肺泡巨噬细胞cDNA文库中筛选出与N蛋白相互作用的10个阳性克隆；将阳性克隆的序列与NCBI数据库中序列比对，结果显示对应着6种蛋白，分别为FTH1、LGALS3、CORO1C、SNRPG、KRTAP5-3和ZNF598，其中LGALS3和SNRPG两种蛋白可能与病毒增殖及凋亡有关，具有进一步研究价值，因此对这两种蛋白进行了回返、自激活和Co-IP实验验证，证实 LGALS3和SNRPG蛋白确实与N蛋白存在特异的相互作用且排除了假阳性的可能。本研究为进一步研究猪流行性腹泻病毒 N蛋白的功能及病毒的致病机制奠定了基础。
　　（2）为了筛选和鉴定N蛋白的抗原表位核心区域，本实验将N基因截短为4个相互重叠的DNA片段N1、N2、N3、N4，将其分别克隆到质粒pCold I中，构建出4个重组质粒pCold I-N1、pCold I-N2、pCold I-N3、pCold I-N4，通过IPTG诱导，进行分段融合蛋白原核表达；将表达的分段蛋白再经 Western blot实验验证，结果显示只有N1（1-126aa）、N2（107-230aa）与N蛋白单克隆抗体反应，说明N蛋白的抗原表位区域在N1-N2（1-230aa）区域。同样的方法与策略，将N1-N2（1-230aa）区域截短为10个相互重叠的DNA片段A1、A2、A3、A4、A5、A6、B1、B2、B3、B4，将其分别克隆到质粒pCold TF中，构建出10个重组质粒，IPTG诱导，进行分段融合蛋白原核表达；将表达蛋白进行Western blot实验验证，结果显示A1（1-190aa）、A2（1-150aa）和B1（1-140aa）能与N蛋白单克隆抗体反应，而其他分段蛋白不反应，可以确认N蛋白的抗原表位在107-140aa区域。本研究确定的N蛋白抗原表位为以后建立特异性病毒诊断方法奠定了基础。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 PEDV概述

1.2 酵母双杂交技术概述

1.3 研究目的和意义

第2章 诱饵载体 pGBKT7-N 的构建和其毒性、自激活效应检测

2.1 前言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果

2.5 讨论

第3章 酵母双杂交法筛选与PEDV N蛋白相互作用的蛋白

3.1 前言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果

3.5 讨论

第4章 PEDV N蛋白抗原表位鉴定

4.1 前言

4.2 材料

4.3 方法

4.4 结果

4.5 讨论

第5章 结论

下一步工作

参考文献

缩略语词汇表

附录I OMEGA Gel Extraction Kit具体步骤

附录II OMEGA Gel Extraction Kit具体步骤

附录III Western blot实验步骤

附录IV质粒转化酵母感受态细胞步骤

致谢

攻读学位期间的研究成果