PRRSV HuN4株和CH-1a株感染性克隆及其嵌合病毒的构建及其初步应用

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种病毒性传染病，临床上主要表现为妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病，因其可引起发病猪耳部发绀成蓝紫色，俗称蓝耳病。目前我国流行的高致病性蓝耳病（HP-PRRS）比经典PRRS致病性更高，危害更大。虽然对PRRSV进行了广泛的研究，但决定其复制和毒力等的相关机制尚不够清楚。感染性克隆是研究PRRSV的重要操作平台，目前大部分的PRRSV感染性克隆是基于体外转录的，这不仅降低了拯救的效率，而且增加了病毒拯救的复杂程度。
　　为高效快速地拯救PRRSV，本研究开展了基于真核启动子的PRRSV反向遗传的构建。通过RT-PCR方法分段扩增了高致病性PRRSV HuN4-F5和经典PRRSV CH-1a的全长基因组片段，克隆至含β-actin真核启动子的低拷贝载体pOKM中，成功构建了pOK-HuN4和pOK-Ch两个全长基因组克隆，经直接转染Marc-145细胞，成功拯救出相应的病毒。其中pOK-CH的成功构建为PRRSV CH-1a株的保种提供了保证。同时在pOK-HuN4和pOK-CH的基础上，分别对其结构蛋白和非结构蛋白进行互换，构建了6株嵌合病毒，即以结构蛋白互换的 pOK-HuN4nsp-CHsp和pOK-CHnsp-HuN4sp，非结构蛋白开放阅读框互换的 pOK-HuN4-CHORF1a、pOK-CH-HuN4ORF1a、pOK-HuN4-CHORF1b和pOK-CH-HuN4ORF1b，并成功拯救出这6株嵌合病毒。在pOK-HuN4的基础上在其ORF7和3’-UTR之间插入海肾荧光素酶报告基因，经拯救后，可检测到荧光信号，为PRRSV的复制监测及中和抗体水平检测等方面提供了应用技术。
　　基于真核启动子的HP-PRRSV HuN4和PRRSV CH-1a株感染性克隆的构建，避免了RNA的体外转录，简化了病毒的拯救过程，提高了病毒拯救的成功率。在此基础上完成了带有海肾荧光素酶报告基因的pOK-HuN4-Rlu以及一系列嵌合毒的构建为今后研究影响PRRSV复制和毒力基因提供了操作平台，同时pOK-HuN4-Rlu的构建也为监测PRRSV复制以及中和抗体的检测提供了技术支持。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1猪繁殖与呼吸综合征概述

1.2反向遗传学

1.3研究的目的和意义

第二章 PRRSV HuN4株和CH-1a株感染性克隆的构建

2.1材料与方法

2.1.7病毒的拯救及鉴定

2.2结果

2.3讨论

第三章 PRRSV HuN4株和 CH-1a株嵌合毒的构建

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

第四章 表达海肾荧光素酶的PRRSV嵌合病毒构建的应用

4.1材料和方法

4.2 结果

4.3讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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