中华蜜蜂抗螨相关基因筛选及表达分析

摘要

狄斯瓦螨(Varroa destructor)被认为是威胁全球蜂群健康的主要因素之一，对全世界的养蜂业都造成了巨大损失。中华蜜蜂作为蜂螨的原始寄主，具有较强的清理能力，能够抵抗螨虫的侵害。为探求中华蜜蜂抗螨行为的分子机制，本文以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为研究对象，通过对染螨前后的中华蜜蜂进行Solexa/ Illumina高通量转录组测序，初步筛选出与中华蜜蜂抗螨行为相关的候选差异基因，并采用RT-PCR和荧光定量PCR的技术，分析了候选差异基因中mab-21和Calcineurin B在中华蜜蜂不同发育阶段的表达差异，并对候选基因进行序列及表达特征分析。主要结果如下：
　　1、通过高通量测序技术检测染螨前后的中华蜜蜂转录组表达差异，将获得的clean reads从头组装获得31739个Unigenes，平均长度为6067bp，并对这些Unigenes进行基因功能注释。基于数据库Nr、GO和KEGG用BlastX进行相似性比对，共有29792个Unigenes被注释。以未染螨中华蜜蜂转录组数据为参考数据，对染螨前后的中华蜜蜂进行分析比较，在染螨后的中华蜜蜂共检测到513个基因有显著表达差异，其中502个基因上调，11个基因下调。
　　2、从中华蜜蜂转录组差异基因中筛选得到mab-21基因。采用RT-PCR方法，获得中华蜜蜂mab-21 cDNA，克隆了中华蜜蜂mab-21的基因编码区，命名为Accmab21，并提交GenBank后获得登录号KR000001。序列分析结果显示,中华蜜蜂mab-21基因的编码区开放阅读框长为1098 bp，共编码365个氨基酸，推测编码蛋白的相对分子量为41.63 kD，等电点为8.53。对mab-21的系统进化进行了分析，表明中华蜜蜂mab-21与西方蜜蜂(Apis mellifera) mab-21、小蜜蜂(Apis florea) mab-21和熊蜂(Bombus impatiens) mab-21聚成一支。
　　3、对中华蜜蜂mab-21在不同发育时期（新出房蜂、哺育蜂、守卫蜂及采集蜂）工蜂头部中mRNA的表达量以及感染大蜂螨前后的表达特性进行了研究。Real-time PCR结果显示，mab-21基因在中华蜜蜂不同发育时期的工蜂头部均有所表达，其中哺育蜂阶段显著高于新出房蜂、守卫蜂和采集蜂(P<0.05)。感染大蜂螨后，哺育蜂和守卫蜂中mab-21基因的表达下降显著(P<0.05)；而在新出房蜂和采集蜂中表达量变化不显著。该基因可能与中华蜜蜂抗螨行为相关。
　　4、从中华蜜蜂转录组差异基因中筛选得到Calcineurin B基因。钙调磷酸酶B（Calcineurin B， CnB）是钙调磷酸酶的调节亚基，钙调磷酸酶在动植物钙信号传导中起重要作用。采用RT-PCR方法克隆了中华蜜蜂Calcineurin B基因编码区。结果表明：该编码区开放阅读框（ORF）长为513 bp，可编码170个氨基酸残基，相对分子量为19.36 Da，等电点为4.33。同源性比较发现，中华蜜蜂CnB的氨基酸序列与西方蜜蜂(A. mellifera)同源性最高，高达99.4％，与熊蜂(B.impatiens)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyx mori)较高，分别为97.1%、97.6%、94.7%和96.5%。通过系统发育树分析可知中华蜜蜂与西方蜜蜂(A. mellifera)、大蜜蜂(A. dorsata)、小蜜蜂(A. florea)等膜翅目昆虫的CnB汇成一支。
　　5、对Calcineurin B基因在中华蜜蜂不同发育时期（新出房蜂、哺育蜂、守卫蜂及采集蜂）工蜂头部中mRNA的表达量以及感染大蜂螨前后的表达规律进行了研究。荧光定量PCR结果表明，Calcineurin B基因在中华蜜蜂工蜂头部的不同发育时期均有表达，各阶段表达量由高到低为：守卫蜂>采集蜂>哺育蜂>新出房蜂(P<0.05)。感染大蜂螨后，新出房蜂和哺育蜂中Calcineurin B基因的表达显著增加(P<0.05)；而采集蜂中表达量显著下降(P<0.05)；守卫蜂中表达量变化不显著。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1 狄斯瓦螨概述

1.2 蜜蜂抗螨机制

1.3 蜂螨的防治方法

1.4 转录组测序技术

1.5 差异表达基因简介

1.6 研究目的和意义

1.7 研究内容

第二章 中华蜜蜂头部转录组文库构建及抗螨相关基因筛选

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 中华蜜蜂MAB21基因克隆及序列分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 中华蜜蜂MAB21基因表达特性分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 中华蜜蜂Calcineurin B基因克隆及序列分析

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第六章 中华蜜蜂Calcineurin B基因表达特性分析

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

第七章 全文结论

7.1 中华蜜蜂头部转录组文库构建及抗螨相关基因筛选

7.2 中华蜜蜂mab-21基因克隆及序列分析

7.3 中华蜜蜂mab-21基因表达特性分析

7.4 中华蜜蜂Calcineurin B基因克隆及序列分析

7.5 中华蜜蜂Calcineurin B基因表达特性分析

7.6 前景展望

参考文献

致谢

作者简历