外源表皮降解蛋白酶基因(Cdep1)转化蜡蚧菌及其酶活性增强效果评价

摘要

蜡蚧菌是一种重要的虫生真菌，对于温室害虫具有良好的防治效果，但是由于其作用过程慢、效果容易受环境的影响，所以在实际应用中受到很大的限制。在蜡蚧菌侵染害虫的过程中，其分泌的蛋白酶、几丁质酶等胞外酶具有重要作用。研究发现，增加生防真菌胞外酶的分泌，能显著地提高真菌的毒力水平。本研究从白僵菌中克隆得到一个蛋白酶基因，将其导入蜡蚧菌中，提高蜡蚧菌的蛋白酶分泌水平，以此改良蜡蚧菌菌株。主要研究结果如下:
　　1.克隆外源蛋白酶基因。从一株性状优良的球孢白僵菌中克隆蛋白酶基因 Cdep1，根据GenBank中已有的白僵菌蛋白酶基因设计引物，同源克隆得到了白僵菌的蛋白酶基因Cdep1。经Blast比对，其与白僵菌蛋白酶基因（HQ840791）的序列同源性为99％。其对应的氨基酸序列与碱性丝氨酸蛋白酶（KGQ12177）的同源性为99%，其中第128位的氨基酸由丝氨酸突变为酪氨酸，239位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸。
　　2.构建了Cdep1蛋白酶的真菌表达载体。以质粒pAN7-1为模板，分别克隆得到启动子GdpA、终止子TrpC。采用重叠PCR的方法，结合降落PCR，构建片段GdpA-Cdep1-TrpC（4021bp）。质粒pBht2和连接片段经过KpnI和HindIII酶切后，使用T4连接酶将该片段与真菌表达质粒pBht2连接，构建了其表达的重组质粒。
　　3.应用了农杆菌转化法和原生质体转化法转化蜡蚧菌。使用重组质粒转化农杆菌感受态，阳性农杆菌在与蜡蚧菌分生孢子共培养2天后转接到抗性平板中，培养至可见单菌落进行验证，结果获得大量的转化子，随机挑选100个转化子做进一步的鉴定。对蜡蚧菌的原生质体转化的条件进行了优化，结果表明蜡蚧菌孢子以1.5×108的浓度接种到土豆液体培养基中，培养24小时，按照1:40的比例加入复配的30mg/mL的裂解液（溶菌酶:纤维素酶:蜗牛酶=2:1:1），酶解3小时，蜡蚧菌的原生质体数量可以达到1.8×107个/g。
　　4.转化子拷贝数鉴定。根据已报道的单拷贝基因 EF1α设计扩增内参引物，采用 Beacon Designer设计目的基因引物AM-3，使用荧光定量PCR技术，对28个转化子进行拷贝数检测。在消除扩增效率和扩增片段大小的差异后，结果显示转化子中单拷贝的有9株，两拷贝和三拷贝的各有1株。保留单拷贝的菌株用于酶活性评价。
　　5.转化子酶生物活力评价。使用紫外分光光度计，通过对蛋白酶水解酪素产生的酪氨酸含量的测定，检测阳性菌株的蛋白酶活力，结果显示，转化子酶活性最高比出发菌株提高了10倍，具有进一步研究的价值。

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第一章引言

1.1蜡蚧菌的侵染过程及其生物防治作用

1.2蜡蚧菌的遗传转化技术

1.3研究目的、内容及技术路线

第二章目的基因克隆

2.1实验材料

2.2试验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

第三章表达载体构建以及蜡蚧菌的转化

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章转化菌株及菌株酶活性变化评价

4.1实验材料

4.2试验方法

4.3结果与分析

4.4讨论

第五章结论与讨论

5.1全文结论

5.2讨论

5.3创新点

参考文献

致谢

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