解淀粉芽孢杆菌来源角蛋白酶的高效表达及羽毛降解工程菌的构建

摘要

角蛋白酶具有降解角蛋白的能力，在饲料、织物处理、清洁剂、医药等行业具有广泛的应用价值，能够产生巨大的社会和经济效益。本研究旨在筛选获得快速羽毛降解菌株，解淀粉芽孢杆菌 K11(Bacillus amyloliquefaciens K11），并通过遗传操作获得角蛋白酶高效表达菌株pBSlac-kerK-SCK6和羽毛降解工程菌K1127，为角蛋白酶的工业应用奠定理论及技术支持。
　　解淀粉芽孢杆菌K11(B. amyloliquefaciens K11)菌株可以利用羽毛作为唯一碳源和氮源，并在24 h内将羽毛完全降解。通过SDS-PAGE以及LC-ESI-MS/MS，确定了角蛋白酶的内肽序列，进一步获得了其完整的kerK基因序列。利用POE-PCR的方法，成功构建了pUB110-kerK表达载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌 SCK6中的表达。通过牛奶平板以及羽毛降解实验，证明了 kerK基因是羽毛降解的关键基因。角蛋白酶 KerK的酶学性质分析表明：以羽毛粉为底物，其最适 pH为11.0，并且在pH6.0-12.0均具有较好的稳定性，最适温度为50 ℃，热稳定性较好，在50 ℃处理30 min酶活力仍保持在70％。
　　在体外羽毛降解实验中，纯化的角蛋白酶KerK(150 U/ml)在还原剂DTT的共同作用下，50 ℃水浴振荡反应30 min能快速降解完整羽毛。酶解产物分析(HPLC-Chip/ESI-QTOF-MS)表明KerK主要是在丝氨酸和一些疏水性氨基酸间将结构牢固且难以再利用的羽毛降解，产生1-3 kDa富含多种必需氨基酸的可溶性寡肽， VVIQPSPVVVTLPGPILSS， IQPSPVVVTLPGPILSS，和ILSEEGVPISSGGF，为羽毛的循环利用尤其是作为饲料原料提供了可能性。
　　为了提高角蛋白酶 KerK的表达量，本研究构建了 pBSlac-kerK诱导型表达载体，并成功的在枯草芽孢杆菌SCK6中实现了表达。在15升发酵罐水平，重组菌最高酶活力可达3500 U/ml，高于目前报道的大多数细菌来源的角蛋白酶酶活力。同时，本研究将构建的pUB110-kerK表达载体转化到原始K11菌株中，构建了kerK基因高拷贝的重组K1127菌株，其羽毛降解效率得到进一步提高：在12 h内能将羽毛几乎完全降解，且在羽毛培养基中的角蛋白酶活力能达到1500 U/ml，比原始菌株提高了6倍。高效的羽毛降解能力，使得该重组工程菌在羽毛粉的制备以及废弃羽毛的处理上具有良好的应用前景。
　　综上所述，本研究通过羽毛降解实验筛选获得了快速羽毛降解菌株B. amyloliquefaciens K11，从中克隆获得了羽毛降解基因kerK，构建了pUB110-kerK组成型表达载体和pBSlac-kerK诱导型表达载体，成功在枯草芽孢杆菌SCK6中进行了表达，并对重组酶进行了纯化、酶学性质分析以及水解产物分析。同时，将构建的组成型表达载体转化到原始 K11菌株中，获得了重组 K1127菌株，该菌株对羽毛的降解效率进一步提高，为羽毛的规模化处理及循环利用奠定了基础。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1 角蛋白

1.2 角蛋白酶

1.3 芽孢杆菌表达系统

1.4 本研究的目的和意义

第二章 Bacillus amyloliquefaciens K11来源角蛋白酶基因克隆、表达及功能研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与分析

2.4 讨论

本章小结

第三章 Bacillus amyloliquefaciens K11来源角蛋白酶基因kerK过表达研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与分析

3.4 讨论

本章小结

第四章 高效羽毛降解工程菌的构建

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.4 讨论

本章小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历