鸡毒支原体S6株P25、P33蛋白粘附特性的研究

摘要

鸡毒支原体（MG）能够引起鸡慢性呼吸道疾病（CRD）与火鸡传染性窦炎，其感染给养禽业造成了严重的经济损失。
　　鸡毒支原体（MG）缺乏典型细胞壁结构，主要通过表面粘附蛋白来粘附、侵染宿主细胞。粘附蛋白是鸡毒支原体定植于宿主细胞表面的关键因子，其在MG致病过程中发挥着重要作用。并且粘附蛋白可作为潜在的诊断用抗原，其在鸡毒支原体感染的诊断应用过程中发挥着至关重要的作用。本研究依据生物信息学软件对MG S6株基因组全部序列的分析，选取了一个675bp的假定膜蛋白基因p25与915bp的假定粘附蛋白基因p33，重点研究它们可能具有的的粘附特性，为MG S6株诊断用抗原的筛选奠定基础。
　　本研究通过定点突变分别获得了可以体外表达的p25与p33基因，并利用原核表达系统分别获得了可溶性表达的P25与P33重组蛋白即（rP25与rP33），然后用纯化后的重组蛋白分别免疫兔子制备rP25与rP33抗血清。分别利用rP25与rP33抗血清对MG S6株及鸡滑液囊支原体（MS）进行鉴别，western blot实验结果显示，rP25与rP33抗血清能将二者鉴别开，因而推断P25与P33可作为潜在的诊断用抗原。同时分别提取MG膜蛋白与浆蛋白组分，western blot实验结果显示P25与P33均在MG S6株的胞膜与胞浆中有分布。激光共聚焦扫描显微镜观察显示，rP25与rP33均能像MG S6一样可以明显粘附到鸡胚成纤维细胞系（DF-1细胞）上。而夹心ELISA检测结果则表明rP25及rP33对DF-1细胞的粘附为特异性粘附，其中兔抗rP25与rP33血清可以明显抑制MG S6对DF-1细胞的粘附作用。流式细胞仪与透射电镜检测结果也同样显示，兔抗rP25与rP33血清能够明显抑制MG S6对DF-1细胞的粘附，并且兔抗rP25与rP33血清联合作用抑制MG S6对DF-1细胞的粘附效果也很显著。从而证明P25与P33均是MG的粘附相关蛋白，并可作为潜在的诊断用抗原，为后续的应用研究奠定基础。
　　为了研究P25与P33粘附到宿主细胞上是否能引起相关的免疫反应，本研究利用实时荧光定量PCR及ELISA实验来检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β以及IFN-γ的转录及表达释放情况。结果均显示rP25及rP33刺激DF-1细胞后相关细胞因子的转录及释放量与对照相比均不同程度的升高，从而证明P25与P33可作为潜在的免疫保护性抗原。
　　综上，证明了P25与P33为鸡毒支原体S6株的粘附相关蛋白，并可作为潜在的诊断用抗原；同时也证明了P25与P33可诱导宿主细胞上调表达IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β以及IFN-γ，并可作为潜在的免疫保护性抗原。这将为MG S6的致病机理的研究与新型亚单位疫苗的研制，乃至其感染的诊断及防控提供理论依据。

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第一章 引 言

1.1 鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum, MG）简介

1.2 鸡毒支原体的致病机理

1.3鸡毒支原体膜相关蛋白及粘附因子的研究

1.4本研究的目的与意义

第二章 p25、p33的序列分析及其原核表达

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4 小结

2.5 讨论

第三章 P25、P33多克隆抗体的制备及其亚细胞定位

3.1材料

3.2 方法

3.3结果

3.4小结

3.5讨论

第四章 P25、P33粘附特性的研究

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 小结

4.5 讨论

第五章 rP25/rP33诱导DF-1细胞细胞因子分泌水平的研究

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4小结

5.5 讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

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