小地老虎性信息素合成激活肽受体(PBANR)的克隆、表达及RNAi研究

摘要

小地老虎 Agrotis ipsilon是一种破坏力很强的迁飞性鳞翅目害虫，危害世界范围内的多种作物。性信息素合成激活肽受体（PBANR），调节多种鳞翅目昆虫性信息素的合成。能够与调控性信息素合成中扮演重要角色的GPCRs结合。在鳞翅目成虫中，交配能够引起雌虫短时间终止性信息素的产生。本文通过RACE-PCR方法，从小地老虎雌虫性腺中克隆获得小地老虎PBANR全长基因，命名为Aips-PBANR，该基因由3539个碱基组成。蛋白序列比对表明，Aips-PBANR与鳞翅目其他昆虫的PBANR具有较高的序列一致性。利用RT-PCR方法，从小地老虎雌虫性腺和雄虫生殖器中均检测到 Aips-PBANR基因的表达。qRT-PCR该基因在成虫不同组织和日龄的表达特征进行研究。结果表明，Aips-PBANR在雌虫性腺中的表达量最高，在雄虫的生殖器中也检测到较低的表达；羽化后第四天上午2:00基因表达量最高；另外，qRT-PCR结果表明，交配能够明显抑制 Aips-PBANR基因的表达，因此进一步证明交配能够抑制昆虫性信息素的产生。
　　RNA干扰技术（RNAi）作为害虫防治的新方法具有很大的应用潜力。然而，在不同昆虫之间RNAi干扰效率存在很大差异。其中，鳞翅目是最难应用RNAi技术的昆虫。本文以小地老虎 Aips-PBANR基因为研究对象，通过分别注射 dsRNA和 siRNA的方法干扰Aips-PBANR基因在雌虫中的表达。对8~9日龄雌虫腹部分别注射20μl siRNA、dsRNA、dsGFP和水，72小时后通过qRT-PCR方法检测沉默效率。结果表明，注射siRNA的试验组， PBANR基因mRNA表达量下调90％以上，注射dsRNA的试验组下调56%，下调水平均显著高于注射dsGFP、水以及未注射的对照组。
　　小地老虎在时间和空间维度上具有令人惊讶的个体生长，种群存活以及繁殖能力。幼虫的爆发与迁飞成虫经历的温度密切相关。然而与种群爆发及迁飞相关的机制目前尚不清楚。本文还在室内研究了不同温度范围（16–36℃）对小地老虎交配、产卵以及寿命的影响。试验结果表明，在24–28℃范围内，成虫的交配率与交配频率最高，超出该范围交配率与交配频率降低；高温条件下，成虫夜间交配起始时间延迟，随着温度增加，交配持续时间降低，同时，产卵前期和产卵期逐渐下降；高峰日和繁殖力最高，并随着温度降低呈下降趋势。另外，温度与成虫寿命关系表明，成虫寿命与温度呈负相关；低温条件下雄虫的寿命高于雌虫；32–36℃，雌虫寿命高于雄虫。因此，认为24–28℃是小地老虎繁殖产卵的最佳温度范围，幼虫危害或爆发可能发生在温度范围在24–28℃的区域，这将为预测种群爆发的区域范围提供重要依据。
　　本文首次从小地老虎雌虫性腺克隆获得了 Aips-PBANR基因。定量研究了该基因转录本在小地老虎不同组织、日龄及交配前后的表达变化。通过雌虫腹部注射siRNA和dsRNA的方法对 Aips-PBANR基因进行沉默。这些研究结果为帮助干扰生殖功能作为害虫管理方法以及理解神经肽受体多样化功能提供可靠的基础。另外，明确不同温度对小地老虎生存及交配的影响规律有利于我们对小地老虎发生为害进行精准监测和预警。

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Abbreviations

List of Figures

List of Tables

CHAPTER 1 Introduction and review of literature

1.1. Black Cutworm

1.2. Distribution of Black cutworm

1.3. Life History and Developmental Stages of BCW:

1.4. Factors and Damages by BCW

1.5. Significance and Migration of BCW

1.6. Economic Importance

1.7. Management of BCW

1.8. Molecular techniques used in the present study

1.9. Objectives

CHAPTER 2 Molecular Cloning, differential expression and mating interruption of Pheromone Biosynthesis Activating Neuropeptide Receptor, a sex pheromone gene in black cutworm, Agrotis ipsilon \(Hufnagel\) \(Lepidoptera:Noctuidae\) adults

2.1. Introduction

2.2. Materials and methods

2.3. Results

2.4. DISCUSSION

CHAPTER 3 Knockdown of pheromone biosynthesis-activating neuropeptide receptor \(PBANR\) in black cutworm, Agrotis ipsilon \(Hufnagel\) \(Lepidoptera: Noctuidae\) adults by RNA interference

3.1. Introduction

3.2. Materials and methods

3.3. Results

3.4. Discussion

CHAPTER 4 The influence of different temperatures on mating traits, oviposition and Longevity of Black cutworm, Agrotis ipsilon \(Hufnagel\) \(Lepidoptera:Noctuidae\)

4.1. Introduction

4.2. Materials and methods

4.3. Results

4.4. Discussion

CHAPTER 5 Conclusions and Recommendations

参考文献

致谢

Author biography