RNAi介导的甜菜夜蛾性信息素合成激活肽及其受体基因的功能鉴定

摘要

甜菜夜蛾spodoptera exigua(Hūbner)是一种重要的迁飞害虫，幼虫危害范围广且经常暴发成灾。在农业生产上甜菜夜蛾极易产生耐药性而导致杀虫剂防治效果锐减，因此，性信息素的开发和利用在甜菜夜蛾的防治中具有广阔的应用前景。甜菜夜蛾性信息素合成激活肽(Pheromonebiosynthesis-activating neuropeptide，PBAN)及其受体(PBAN receptor，PBANR)是甜菜夜蛾性信息素合成重要的调控因子，本论文利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术研究了甜菜夜蛾PBAN及其受体PBANR的功能，为更好地开发利用甜菜夜蛾性信息素提供了重要的理论依据。主要结果如下:
　　1.获得了5个对甜菜夜蛾PBANR基因有干涉效果的RNAi片段。根据PBANR基因序列设计并合成了1个dsRNA片段、6个siRNA干扰片段（R001-006）及1个阴性对照片段(Ncontrol)，分别对羽化前一天的甜菜夜蛾雌蛹前胸和初羽化的甜菜夜蛾雌蛾腹部8-9节进行微量注射，利用实时荧光定量PCR技术检测了注射后24h、48h及72h后PBANR基因mRNA的相对表达量，结果显示:蛹期注射dsRNA后24h和48h甜菜夜蛾PBANR基因的表达量显著上升，72h后与未作任何处理的阳性对照相比无显著差异;R001在蛹期注射后24-72h与注射Ncontrol的阴性对照相比PBANR基因表达均无显著变化，在成虫期注射后24h和72h显著刺激PBANR的表达;R002蛹期注射后48h与注射Ncontrol的阴性对照相比PBANR的表达量显著升高，72h的干扰效果显著，与阴性对照相比抑制率为22.6％，成虫期注射后24h和48h靶基因的表达显著上升，72h后与对照相比无显著差异;R003在蛹期注射后24h和注射后72h的干扰效果显著，与阴性对照相比72h的抑制率为33％，在成虫期注射后仅在48h对靶基因的表达有刺激作用。
　　将R004-R006分别注射进初羽化的雌蛾腹部8-9节后发现，R004在注射后48h及72h的干扰效果显著，其抑制率分别为29.02％和30.57％; R005在注射后72h有显著的干扰效果，其抑制率为34.87％; R006在注射后24h和72h的干扰效果显著，其中72h的抑制率为44.3％。通过以上实验表明并不是所有干扰片段都会有干涉效果，只有在根据特定位点设计的序列才能对靶标基因起到沉默效果，且同一干扰片段注射不同部位可能有不同的效果。
　　2.获得了1个对甜菜夜蛾PBAN基因有干涉效果的siRNA，并揭示了基因干涉后对甜菜夜蛾交配与产卵的影响。根据PBAN基因序列设计并合成了2个siRNA(N001，N002)片段及1个阴性对照片段(Ncontrol)，对羽化前一天的甜菜夜蛾雌蛹前胸进行了注射，利用实时荧光定量PCR技术检测了注射后24h、48h及72h后PBAN基因mRNA的相对表达量，结果显示:对羽化前一天的雌蛹前胸注射N00124h后有显著的干扰效果，PBAN基因的表达量被抑制66.3％，在注射后48h这种抑制效果消失且72h后PBAN基因表达显著上升;注射N002后24-48h无显著抑制效果，72h后表达反而上升。
　　根据N001对PBAN表达的抑制效果，进一步检测了N001干扰PBAN表达后甜菜夜蛾生物学特性的变化，结果显示:N001在注射后1d显著降低了成虫交配率和交配次数，随着注射后时间的增加这种抑制效果逐渐消失，从2d开始对照和处理之间已经无显著差异;注射N001后对已经交配的成虫产卵量与对照相比无显著差异。这表明，尽管甜菜夜蛾PBAN基因干涉后能显著抑制其转录表达，但这种抑制作用持续时间较短，甜菜夜蛾会快速修复PBAN基因的正常表达，以保证成虫交配和生殖的正常进行。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 甜菜夜蛾的发生与危害

1．2 鳞翅目昆虫性信息素的生物合成与调控

1．2．1 鳞翅目昆虫的性信息素的组份

1．2．2 甜菜夜蛾的性信息素组份

1．2．3 鳞翅目昆虫性信息素生物合成的调控

1．3 鳞翅目昆虫PBAN与PBANR的研究现状

1．3．1 PBAN的研究现状

1．3．2 PBANR的研究现状

1．4 RNAi在揭示基因功能中应用进展

1．4．1 RNAi的作用机理

1．4．2 RNAi在鳞翅目昆虫中的应用进展

1．5 研究目的与意义

第二章 甜菜夜蛾PBANR基因的功能鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 供试虫源及饲养方法

2．1．2 主要试剂及试剂盒

2．1．3 常用仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 dsRNA的设计

2．2．2 dsRNA的制备

2．2．3 siRNA的合成及使用方法

2．2．4 注射方法、部位、龄期

2．2．5 注射体积的确定

2．2．6 试虫处理及实验方法

2．2．7 荧光定量PCR检测RNAi效应

2．3 结果与分析

2．3．1 dsRNA的制备

2．3．2 dsRNA及siRNA注射方法及龄期的确定

2．3．3 注射体积的确定

2．3．4 基因定量片段的确认

2．3．5 定量PCR特异性引物的筛选

2．3．6 相对标准曲线的制备

2．3．7 雌蛹前胸注射dsRNA后PBANR基因的相对表达量差异

2．3．8 雌蛹前胸注射R001-003后PBANR基因的相对表达量差异

2．3．9 雌蛾腹部注射R001-003后PBANR基因的相对表达量差异

2．3．10 雌蛾腹部注射R004-006后PBANR基因的相对表达量差异

2．4 小结

第三章 甜菜夜蛾PBAN基因的功能鉴定

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 siRNA的合成及使用方法

3．2．2 注射方法、部位、龄期

3．2．3 注射体积的确认

3．2．4 试虫处理及实验方法

3．2．5 荧光定量PCR检测RNAi效应

3．2．6 甜菜夜蛾PBAN基因沉默后生物学测定

3．3 结果与分析

3．3．1 基因定量片段的确认

3．3．2 定量PCR特异性引物的筛选

3．3．3 相对标准曲线的制备

3．3．4 雌蛹前胸注射N001、N002后PBAN基因的相对表达量差异

3．3．5 甜菜夜蛾PBAN基因沉默后生物学特性的变化

3．4 小结

第四章 讨论

4．1 PBANR基因dsRNA的合成

4．2 微量注射

4．3 甜菜夜蛾脑-咽下神经节复合体总RNA的提取

4．4 荧光定量PCR扩增效率的优化

4．5 RNAi干涉效果的影响因素

参考文献

致谢

作者简历