小麦条锈菌温度敏感性及热胁迫下差异蛋白质组学研究

摘要

由小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起的小麦条锈病是小麦生产上危害最为严重的世界性病害。近年来国内外的研究发现，小麦条锈菌对高温的适应性在全球气候变化的大背景下有所增强。本研究利用21个已知抗条锈病基因的近等基因品系对2010-2011年小麦生长季采自6个省市78株已知温度敏感性（ET50）的小麦条锈菌群体进行毒性鉴定，并利用AFLP技术对其进行遗传多样性分析，明确了小麦条锈菌毒性、遗传多样性以及温度敏感性三者之间的关系。对不同温度耐受类型菌株在热胁迫条件下的体外萌发、侵染过程及差异表达蛋白进行了分析，从组织学和蛋白质组学两个层面初步阐明小麦条锈菌温度耐受性的机制。具体结果如下：
　　1.小麦条锈菌对温度敏感性与毒性及遗传多样性关系
　　利用21个已知抗条锈病基因近等基因系作鉴别寄主对条锈菌株进行毒性鉴定结果表明，不同省市小麦条锈菌群体的毒性基因多样性存在一定差异，甘肃菌株群体毒性多样性指数H值最高（0.2693），云南菌株群体最低（0.1504）。遗传多样性结果显示，6省市小麦条锈菌群体遗传多样性指数 H值范围在0.1255~0.1653之间，遗传一致度 GI为0.9647~0.9872，遗传距离 GD为0.0129~0.0360。条锈菌毒性、遗传多样性和温度敏感性三者的相关性分析表明，条锈菌群体毒性多样性与平均ET50存在显著负相关，与ET50变异系数呈正相关，而与遗传多样性没有显著的相关关系。
　　2.不同温度耐受型的小麦条锈菌的生物学特性
　　选择不同温度耐受类型菌株各2株在10℃、15℃、20℃、25℃进行体外萌发差异试验，发现在正常温度和高温胁迫下耐高温菌株的萌发较不耐高温菌株更早、萌发率更高。具体表现为在最适温度（10±0.3℃）条件下萌发24 h后，不同温度耐受类型菌株的萌发率均能达到80％以上，但耐高温菌株要显著早于不耐高温菌株，不耐高温菌株3 h的萌发率不足10％，而耐高温菌株在65-80%之间；随着温度的升高，不耐高温菌株的萌发率显著下降，25℃条件下萌发24 h孢子萌发率不足20％，而耐高温菌株均在90％以上。
　　对不同温度耐受类型菌株在高温胁迫条件下的侵染过程观察发现，菌株接种小麦幼苗24 h后，不同温度耐受性菌株的生长发育进度存在显著差异，在10℃下24 h即开始形成吸器母细胞和吸器结构，但在21℃下没有发现该结构的形成，说明高温抑制了条锈菌菌丝的分化从而延迟菌株的侵染过程；随着时间的推移，耐高温菌株菌丝分枝数、菌落线性长度、吸器母细胞和吸器数在10℃和21℃下的差异较小，而不耐高温菌株在10℃和21℃下的差异显著；耐高温菌株在21℃下48 h-96 h内的菌丝分枝数、菌落线性长度、吸器母细胞和吸器数及其侵染速率都显著高于不耐高温菌株，说明在高温条件下，耐高温菌株的温度耐受性及侵染力显著高于不耐高温菌株。
　　3.不同温度耐受型的小麦条锈菌的蛋白质组学差异
　　利用基于同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ技术）的比较蛋白质组学对小麦条锈菌耐高温菌株萌发阶段热胁迫前后的差异表达蛋白进行研究，共鉴定到2575个蛋白，其中差异表达上调蛋白87个，下调蛋白123个。生物信息学分析结果表明，耐高温菌株热胁迫后参与氧化应激反应，超氧自由基的清除血红素过氧化物酶、过氧化氢酶、硫氧还蛋白还原酶表达上调，从而使细胞内氧化还原及生理活动恢复稳定状态，参与胁迫应答反应的GTP结合蛋白YPT1、GTP结合蛋白YPT3及AGC蛋白激酶表达也上调；参与糖酵解途径的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和6-磷酸葡萄糖异构酶表达上调，为热胁迫后的菌株提供能量；与镁离子结合功能相关的葡萄糖磷酸变位酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶、烯醇酶及无机焦磷酸酶的表达上调，从而维持细胞内正常的生理生化反应。

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第一章 引 言

1.1 小麦条锈病的危害及流行

1.2 小麦条锈菌的生物学特性

1.3 小麦条锈菌温度适应性研究现状

1.4 病原真菌耐热机制的研究现状

1.5 iTRAQ技术在病原真菌比较蛋白质组学中的应用研究

1.6 研究目的及意义

第二章 小麦条锈菌温度敏感性与毒性及遗传多样性的关系

2.1 材料和方法

2.2 结果与分析

第三章 小麦条锈菌耐高温菌株生物学特性分析

3.1 材料和方法

3.2 结果与分析

第四章 耐高温小麦条锈菌热胁迫下的蛋白质组学差异

4.1 材料和方法

4.2 结果与分析

第五章 结论与讨论

5.1 小麦条锈菌对温度敏感性与毒性及遗传多样性关系

5.2 不同温度耐受型小麦条锈菌的生物学特性

5.3 耐高温小麦条锈菌热胁迫下的蛋白质组学差异

第六章 全文结论与展望

一、初步明确了温度敏感性与毒性和遗传多样性之间的关系

二、初步明确了不同温度耐受型的小麦条锈菌的生物学特性

三、完成了不同温度耐受型小麦条锈菌差异蛋白的筛选

后续研究展望

参考文献

附录

致谢

作者简历