益生菌制剂对断奶仔猪肠道黏膜屏障功能的影响及其机理的研究

摘要

断奶应激会对仔猪生产性能及肠道健康产生不良影响，使仔猪出现腹泻、生长缓慢、抵抗力下降等问题。生产中常以超量使用氧化锌作为缓解措施，存在食品安全及生态环境污染等隐患。而益生菌制剂作为环保型添加剂在仔猪生产中的应用越来越广泛。本文从保护和改善仔猪肠道黏膜屏障功能的角度出发，研究益生菌缓解仔猪断奶应激、改善肠道健康的作用及相关机理，为益生菌替代氧化锌在仔猪生产中应用提供一定的理论支持。本研究内容如下：
　　试验一，酪酸梭菌与唾液乳酸菌对急性腹泻大鼠肠道黏膜屏障功能的影响
　　试验选取清洁级21d断奶wistar大鼠（57.45±6.23 g）48只，随机分在4个处理组：对照组（C1）、模型对照组（C2）、酪酸梭菌组（T1）、唾液乳酸菌组（T2）。每组6个重复，每个重复2只大鼠。试验期共9天，对照组（C1、C2）经口灌服生理盐水，试验组（T1、T2）分别灌服酪酸梭菌和唾液乳酸菌。第8天开始除C1外，其余各组灌服番泻叶制剂致泻，记录各组大鼠腹泻情况。试验结束后采集大鼠血液及肠道样品。结果表明：
　　1）灌服番泻叶后各组大鼠均出现腹泻。与C1组相比，C2组稀便率、腹泻指数、血清内毒素及D-乳酸含量显著提高（P<0.01）；而与C2组相比，T1、T2组腹泻指数、血清内毒素及D-乳酸含量均显著降低（P<0.01）。
　　2）与C2组相比，T1、T2组隐窝深度显著降低（P<0.05），绒毛高度与隐窝深度的比值（绒腺比）显著升高（P<0.01），且T1组紧密连接Zonula Occludens-1蛋白(ZO-1)和Occludin蛋白 mRNA水平的相对表达量显著升高（P<0.05）。
　　3）C2组IL-10、IL-1βmRNA水平的相对表达量显著高于C1组（P<0.05）；而与C2组相比，T1组IL-10 mRNA水平的相对表达量显著降低（P<0.01）。
　　以上结果说明，酪酸梭菌或唾液乳酸菌可在一定程度上缓解由番泻叶引起的大鼠急性腹泻，降低肠道通透性，改善回肠组织形态；同时酪酸梭菌在紧密连接蛋白及黏膜细胞因子表达方面优于唾液乳酸菌。
　　试验二，酪酸梭菌对断奶仔猪肠道黏膜屏障功能的影响及其机理的研究
　　试验选用杜×长×大三元杂交仔猪18只（5.35±1.33 kg），于21日龄断奶，随机分为三组，每组6个重复，每个重复1头猪分别饲喂基础日粮（对照组，C组）、基础日粮+500 mg/kg酪酸梭菌（酪酸梭菌组，T组）、基础日粮+3000 mg/kg氧化锌（氧化锌组，ZnO组），试验期共14天。结果表明：
　　1）试验期内各处理组仔猪之间生长性能无显著差异（P>0.05）；添加酪酸梭菌或氧化锌后，断奶仔猪腹泻率明显降低（P<0.05），同时仔猪回肠隐窝深度显著降低（P<0.05）、回肠绒腺比显著升高（P<0.01）；而T组与ZnO组断奶仔猪在腹泻率、回肠道组织形态上均无显著差异（P>0.05）。与C组相比，ZnO组仔猪空肠绒毛高度显著升高（P<0.05），回肠中性酸性杯状细胞数量显著增多（P<0.05），同时ZnO组与T组仔猪回肠的总杯状细胞数有增多的趋势（P<0.1）。
　　2）试验第7天和第14天，T组与ZnO组仔猪血清内毒素及D-乳酸含量均显著低于C组（P<0.05），T组与ZnO组之间无显著差异（P>0.05）。与C组相比，T组与ZnO组仔猪回肠与结肠Occludin mRNA水平的相对表达量均显著升高（P<0.05）； T组与ZnO组在紧密连接表达量上均无显著差异（P>0.05）。与C组相比，酪酸梭菌或氧化锌均显著提高了断奶仔猪回肠、结肠的紧密连接蛋白ZO-1与Occludin的蛋白水平表达量（P<0.05）。
　　3）与C组相比，添加氧化锌或酪酸梭菌均显著降低了仔猪回肠黏膜促炎性细胞因子IL-1β及结肠促炎性因子TNF-αmRNA水平的表达量（P<0.05），显著提高了结肠黏膜抗炎性因子TGF-β1的基因表达量（P<0.05）。在回肠及结肠黏膜中，T组与ZnO组仔猪分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的含量均显著高于对照组（P<0.05）。在以上指标中，ZnO组与T组之间无显著差异（P>0.05）。
　　4）与C组相比，T组仔猪回肠黏膜中TLR2、MyD88、NF-κB、TRAF6的mRNA水平的相对表达量均显著提高（P<0.05），而TAK1的表达量显著降低（P<0.05）； T组与ZnO组仔猪在NF-κB、TAK1、p38MAPK的表达量上无显著差异（P>0.05），但酪酸梭菌显著上调了TLR2、MyD88、TRAF6的基因表达（P<0.05）。在结肠黏膜中，与C组相比，酪酸梭菌显著上调了TLR2、NF-κB的基因表达量（P<0.05），同时具有上调MyD88、TRAF6表达量的趋势（P<0.1）。T组与ZnO组仔猪在结肠黏膜TLR2、MyD88、NF-κB、TRAF6、TAK1、p38MAPK的基因表达量上均无显著差异（P>0.05）。
　　5）在仔猪回肠黏膜中，所测得的微生物主要归属于厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）及放线菌门（Actinobacteria）。三个处理组物种的丰富程度与组成的均匀程度均是C组>T组>ZnO组。Beta多样性分析表明，T组生物群落聚类相对集中，各样本之间距离相近；而C组与ZnO组各样本之间相对离散，个体之间差异较大。各处理组在门水平之间无显著差异。但与 C组相比， ZnO组与 T菌组显著增加了梭菌科（Clostridiaceae）及链霉菌科（Streptomycetaceae）微生物的数量（P<0.05）；同时显著降低了毛螺菌科（Lachnospiraceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）及诺卡氏菌科（Nocardiaceae）微生物的数量（P<0.05）。经功能预测发现，T组回肠黏膜微生物群落在细胞活性、信号转导、基因复制与修复、代谢功能如外源物质降解与代谢、碳水化合物及氨基酸代谢等功能上具有潜在价值；而ZnO组主要集中在代谢功能上，如脂类代谢、萜类和酮类化合物代谢、异源物质代谢、氨基酸代谢等。
　　综合以上结果，断奶仔猪饲粮中添加酪酸梭菌制剂可以显著降低仔猪腹泻率，改善肠黏膜组织形态，降低肠黏膜通透性，上调紧密连接蛋白的表达，其改善肠道功能的作用与高剂量氧化锌无显著差异；酪酸梭菌增强仔猪肠道黏膜屏障功能可能通过两个途径：一方面调控黏膜TLR/NF-κB免疫通路，刺激肠道免疫功能；另一方面稳定和改善断奶后仔猪回肠黏膜微生物区系，维护肠道微生态平衡。本试验结果表明，酪酸梭菌制剂可以替代高剂量氧化锌缓解仔猪断奶应激，保障仔猪生产性能的正常发挥。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1 研究的目的和意义

1.2 国内外研究进展

1.3 研究内容和技术路线

第二章 酪酸梭菌与唾液乳酸菌对急性腹泻大鼠肠道黏膜屏障功能的影响

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 本章小结

第三章 酪酸梭菌对断奶仔猪肠道黏膜屏障功能的影响及机理的研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 本章小结

第四章 全文结论

4.1 结论

4.2 有待深入研究的问题

参考文献

附录

附1 各处理组特征菌群

附2 各处理组菌群功能基因预测

致谢

作者简历