玉米5-甲酰四氢叶酸环化连接酶基因的克隆及其在叶酸代谢调控中的功能研究

摘要

叶酸作为介导一碳代谢的重要辅因子，参与生物体内的多种代谢活动。5-甲酰四氢叶酸环化连接酶（5FCL）被报道催化贮存形式的5-甲酰四氢叶酸（5-CHO-THF）向代谢活性形式的叶酸转化，本文对玉米中的5-甲酰四氢叶酸环化连接酶（5FCL）进行了克隆和功能分析。通过体外酶活分析及在拟南芥中过表达实验验证了其蛋白功能，分析了玉米中Zm5FCL的表达模式和亚细胞定位，并对玉米胚和胚乳中叶酸的分布及叶酸合成、代谢基因的表达模式进行了分析，取得的主要研究结果如下：
　　1、基于拟南芥At5FCL的蛋白序列，我们从玉米中克隆了其同源蛋白(GI:GRMZM5G807835)，命名为Zm5FCL。与番茄和拟南芥5FCL蛋白序列比对，结果显示序列相似度分别达到53.07％和52.38%，与人类、酵母、细菌的相似度分别达到22%-28%。Zm5FCL蛋白中包含5-formyltetrahydrofolate cycloligase结构域，推测其可能存在功能的保守性。
　　2、Zm5FCL体外蛋白酶活测定及其在拟南芥5fcl突变体和野生型中的过表达分析结果显示：体外酶活体系中Zm5FCL蛋白能够将5-CHO-THF转化为5,10-次甲基四氢叶酸（5,10-CH=THF）；在5fcl突变体中过表达 Zm5FCL后，突变体叶片中5-CHO-THF含量恢复到野生型水平，说明Zm5FCL能够互补At5FCL的功能；在野生型拟南芥中过表达Zm5FCL时，叶片中的5-CHO-THF显著降低。
　　3、利用玉米原生质体瞬时表达分析显示，初步判定Zm5FCL：：GFP融合蛋白定位于细胞质中。在玉米籽粒发育过程中，Zm5FCL基因在胚中的表达量明显高于胚乳。叶酸水平检测分析显示，5-甲基四氢叶酸（5-CH3-THF）含量在胚和胚乳之间存在存在显著差异，胚中明显高于胚乳，而胚和胚乳中的5-CHO-THF含量没有明显差异。
　　4、通过对胚和胚乳中叶酸合成及一碳代谢相关基因的转录水平进行分析，发现ZmGTPCHI-2， ZmGDCH-1，ZmGDCT，ZmDHC5，Zm10-FDF，Zm5FCL六个基因在胚中表达水平明显高于胚乳， ZmDHNA1，ZmHPPK，ZmADCL2，ZmDHFR-1，ZmDHFR-2，ZmDHFR-4，ZmGDCH-4，ZmGDCP， ZmDHC1，ZmDHC4，ZmMTHFR1，ZmMTHFR2在胚乳中的表达水平明显高于胚，这些结果说明玉米胚和胚乳中叶酸的合成和分布存在着不同的调控机制。

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英文缩略表

第一章 绪论

1.1 叶酸

1.2 叶酸的生物学功能

1.3 5FCL的研究进展

1.4 本实验的研究目的及意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 结果与分析

3.1 Zm5FCL基因的克隆与序列分析

3.2 Zm5FCL的体外酶活性分析

3.3 拟南芥中Zm5FCL基因过表达时的叶酸水平分析

3.4 Zm5FCL融合蛋白的亚细胞定位

3.5 Zm5FCL基因表达模式分析

3.6 玉米B73材料中胚和胚乳的叶酸含量检测

3.7 玉米籽粒中叶酸合成、一碳代谢基因的转录水平分析

第四章 讨论

第五章 结论

5.1 结论

5.2 创新点

参考文献

附录

致谢

作者简历