IPPBI0TSUC1012 Bt菌株杀虫蛋白对灰飞虱的致死作用机理

摘要

灰飞虱（Laodelphax striatellus）属半翅目飞虱科，是我国水稻上的重要害虫之一。灰飞虱可传播多种植物病毒病，对水稻生产造成严重威胁，亟待突破绿色防控技术以控制灰飞虱对水稻生产的影响。苏云金芽胞杆菌（Bt）是一种革兰氏阳性细菌，能够产生一系列具有高度特异性的杀虫晶体蛋白（ICPs），但对稻飞虱、蚜虫等半翅目害虫的杀虫活性报道较少。本研究组从苏云金芽胞杆菌IPPBI0TSUC1012菌株中分离纯化出的 ST-1、ST-2蛋白对灰飞虱若虫具有很高的杀虫活性，本文观察了灰飞虱取食ST-1、ST-2蛋白后中肠上皮细胞的病理变化，对ST-1、ST-2蛋白在灰飞虱中肠上皮细胞进行了定位，初步探索了ST-1、ST-2蛋白的受体类型。结果可进一步明确ST-1、ST-2蛋白对灰飞虱的致死作用机理，拓宽Bt杀虫蛋白的杀虫谱，为筛选对刺吸性口器害虫有效的杀虫蛋白提供理论依据。主要结果如下：
　　1.在灰飞虱3龄若虫分别取食含有 ST-1、ST-2蛋白（5μg/ml）和对灰飞虱无杀虫活性的Cry1Ac蛋白（5μg/ml）的人工饲料后，利用透射电镜（TEM）比较研究了中肠组织的病理变化。结果表明，取食ST-1、ST-2蛋白后，灰飞虱中肠上皮细胞微绒毛发生消解，细胞质皱缩、空泡化，线粒体内脊膨化，内质网断裂为细小泡状结构，核膜膨胀，染色质凝聚，并且损伤随着取食时间的延长而加重；相比之下，取食Cry1Ac蛋白的灰飞虱微绒毛、围微绒毛基质健康，但是上皮细胞出现不同程度的损伤；取食正常饲料的灰飞虱中肠上皮细胞无明显病理变化。
　　2．制备了ST-1、ST-2蛋白的多克隆抗体，在灰飞虱3龄若虫取食含有ST-1、ST-2蛋白（5μg/ml）的人工饲料后，利用免疫组织化学方法（immunohistochemistry）对中肠组织中的ST-1、ST-2蛋白分布情况进行了检测，并对ST-1、ST-2蛋白在灰飞虱中肠内的受体进行了定位。Western blot结果显示，所制备的ST-1、ST-2蛋白多克隆抗体的稀释倍数可达到20,000倍，且特异性较强；组织切片分析表明，ST-1、ST-2蛋白主要分布在灰飞虱中肠上皮细胞表面的刷状缘膜囊（BBMV）和围微绒毛基质上；全组织分析表明，ST-1、ST-2蛋白主要分布于中肠上皮细胞内，且更加集中于细胞膜表面，中肠肌肉层有零星分布，ST-1、ST-2蛋白对中肠肌肉层可能存在非特异性结合。
　　3．利用甲基-β-环糊精（MbCD）和磷脂酰肌醇特异的磷脂酶 C（PI-PLC）对灰飞虱中肠BBMV进行处理，并通过ST-1、ST-2蛋白与处理前后的BBMV孵育结合，初步研究ST-1、ST-2蛋白在灰飞虱中肠BBMV上的可能受体类型。结果表明，MbCD和PI-PLC处理灰飞虱中肠BBMV后，ST1、ST-2蛋白与灰飞虱中肠BBMV的结合强度并未出现明显下降，表明灰飞虱体内ST-1、ST-2蛋白的受体并非是胆固醇和 GPI锚定蛋白，其对灰飞虱的致死作用机理不同于成孔蛋白，为一种新的作用方式，尚需进一步的深入研究。

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第一章 引 言

1.1 苏云金芽胞杆菌

1.1.1 苏云金芽胞杆菌及Bt杀虫蛋白

1.1.2 不同 Bt 杀虫蛋白的作用机理

1.1.3 Bt杀虫蛋白对不同昆虫的致死作用机理研究

1.1.4 Bt杀虫蛋白对控制半翅目害虫的研究进展

1.1.5 Bt 杀虫蛋白对稻飞虱毒性的研究

1.2 水稻灰飞虱

1.2.1 灰飞虱及其危害

1.2.2 灰飞虱的主要防治措施及存在的问题

1.3 本研究的目的与意义

第二章 取食ST-1、ST-2蛋白后灰飞虱若虫中肠组织的病理变化

2.1 试验材料和方法

2.1.1 供试水稻

2.1.2 供试虫源

2.1.3 主要仪器及试剂

2.1.4 人工饲料

2.1.5 ST-1、ST-2蛋白的提取与纯化

2.1.6 饲喂方法

2.1.7 中肠取样

2.1.8 中肠组织处理与电镜观察

2.2 试验结果

2.2.1 ST-1、ST-2蛋白的提取、纯化与定量

2.2.2 灰飞虱中肠细胞超微结构变化

2.2.3 取食含有ST-1、ST-2和Cry1Ac饲料的中肠细胞病理变化比较

2.3 讨论

第三章 ST-1、ST-2蛋白在灰飞虱若虫中肠内受体的定位

3.1 试验材料和方法

3.1.1 ST-1、ST-2蛋白多克隆抗体的制备与纯化

3.1.2 中肠取样

3.1.3 中肠组织处理及电镜观察

3.1.4 中肠组织处理及共聚焦显微镜观察

3.2 试验结果

3.2.1 ST-1、ST-2蛋白抗体效价

3.2.2 ST-1、ST-2蛋白在灰飞虱中肠上皮细胞的定位

3.2.3 ST-1、ST-2蛋白在灰飞虱中肠肠道内的定位

3.3 讨论

第四章 ST-1、ST-2蛋白受体类型初探

4.1 试验材料和方法

4.1.1 主要仪器及试剂

4.1.2 灰飞虱中肠BBMV的提取

4.1.3 灰飞虱中肠BBMV与ST-1、ST-2蛋白结合

4.1.4 灰飞虱中肠BBMV去胆固醇与ST-1、ST-2蛋白结合

4.1.5 灰飞虱中肠BBMV GPI锚定蛋白与ST-1、ST-2蛋白结合

4.2 试验结果

4.2.1 灰飞虱中肠BBMV与ST-1、ST-2蛋白的结合情况

4.2.2 灰飞虱中肠BBMV去胆固醇与ST-1、ST-2蛋白的结合情况

4.2.3 灰飞虱中肠BBMV GPI锚定蛋白与ST-1、ST-2蛋白的结合情况

4.3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历