水稻黄叶突变体ys94的鉴定与基因定位

摘要

绿色植物的叶绿体具有光合作用固定CO2并合成有机物的能力。其中叶绿素以及叶黄素作为叶绿体内含量最丰富且具有重要功能的色素成分，对植物的生长发育具有重要意义。成熟的叶绿体是从原质体发育而来的，由起主导作用的核基因和叶绿体基因共同调控。在探索叶绿体发育机制以及叶绿素合成途径的研究中，叶色突变体植株是理想的材料。叶绿素含量以及叶绿体发育是否良好直接关系到植物光合作用效率的高低，因此在了解叶绿体发育以及色素合成的机制后，可以通过分子生物学的手段提高植物的光合作用效率，对粮食作物产量的提高具有重要促进作用。本研究对应的材料是一个化学诱变获得的黄叶突变体，突变基因经图位克隆而分离得到，经分子生物学手段对该突变基因的功能进行了初步研究。主要研究结果如下：
　　1.水稻黄叶突变体ys94的表型分析
　　通过化学诱变获得一个遗传稳定的水稻黄叶突变体ys94。与野生型亲本相比，ys94突变体在萌发时即出现黄白叶性状，叶绿素a、叶绿素b含量显著下降，直到三叶期表型开始逐渐减弱，然后开始转绿。突变体与野生型相比幼苗期株高、叶形等无明显差异，成熟后性状表型差异不明显。透射电镜观察表明，ys94突变体的叶绿体数量明显减少，单个叶绿体发育异常，类囊体片层退化。用激光共聚焦显微镜观察野生型和突变体ys94三叶期第三叶的叶片中叶绿体自体荧光的密集程度。结果发现，与野生型相比，突变体ys94发光细胞数目明显减少，显示突变体正常发育的叶绿体减少。这与叶片的表型和叶绿素含量测定的结果相一致。
　　2.目标基因的定位情况
　　突变性状受一隐性核基因调控，经图位克隆，目标基因被定位于8号染色体短臂端140Kb的区间，此区间包含11个候选基因。基因组序列分析发现，ys94突变体在基因Os08g12840编码区第490个碱基处的碱基T突变成碱基A，从而造成编码蛋白序列第163位的色氨酸变成了精氨酸。该基因可能影响脂肪酸的合成，在水稻中该基因尚未有被报道，本研究结果为该基因的克隆和功能分析奠定了基础。
　　3.目标基因表达蛋白的亚细胞定位
　　利用水稻原生质体进行目标基因的瞬时表达，发现在野生型及突变体中目标基因表达蛋白分布在叶绿体中，表明该基因编码一个叶绿体功能相关蛋白。
　　4.目标基因的组织特异性表达、光合作用色素合成相关基因的表达分析
　　通过定量 RT-PCR，我们发现目标基因在各个组织器官中均有表达，尤其在幼叶中的表达量最高。在常温30℃/25℃处理时，突变体三叶期苗叶片经 RT-PCR检测，结果发现突变体中相关基因的表达量下调。因此，突变体ys94的叶绿素含量降低可能是由于叶绿素合成途径和光系统相关基因表达紊乱所致，使光合系统的蛋白质合成减少或缺乏，导致光系统不能正常组装，最终导致叶绿体发育缺陷。

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第一章 引言

1.1 水稻叶色突变体的研究概况

1.1.1 叶色突变体类型及来源

1.1.2 叶色突变的发生机制与常见表型

1.2 高等植物叶绿素合成的研究近况

1.2.1 叶绿素合成途径的研究

1.2.2 叶绿素合成及其它叶色相关基因的研究

1.3高等植物叶绿体发育的研究近况

1.3.1叶绿体的合成、结构与功能的研究

1.3.2 叶绿素合成与叶绿体发育的关系

1.4 叶色突变体在理论研究及生产中的意义

第二章 水稻黄化突变体ys94的鉴定及定位

2.1 材料与方法

2.1.1 植物材料

2.1.2 ys94表型分析

2.1.3 测定叶绿素含量

2.1.4 农艺性状调查

2.1.5 叶片透射电镜观察

2.1.6 激光共聚焦显微镜观察叶绿素自体荧光

2.1.7 ys94遗传分析

2.1.8 ys94的基因定位

2.2 结果及分析

2.2.1 ys94突变体表型及农艺性状统计

2.2.2 ys94的遗传分析

2.2.3 野生型与突变体内色素含量分析

2.2.4 突变体ys94叶绿体结构的透射电镜观察

2.2.5 ys94中叶绿素合成水平的分析

2.2.6 ys94的基因定位

2.2.7 突变基因的候选基因测序验证

2.3 讨论

第三章 目标基因Os08g12840的功能分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料种植

3.1.2 RNA提取与反转录

3.1.3 候选基因的确定

3.1.4 同源对比和及进化树分析

3.1.5 定量RT-PCR

3.1.6 目标基因表达蛋白的亚细胞定位

3.2 结果及分析

3.2.1 突变基因Os08g12840的初步确定

3.2.2 Os08g12840的同源分析

3.2.3 Os08g12840的组织表达分析

3.2.4 相关基因的表达分析

3.2.5 Os08g12840的亚细胞定位

3.2.6 脂肪酸含量测定

3.3 讨论

第四章 全文总结

参考文献

附录

致谢

作者简历