西双版纳黄瓜β-胡萝卜素生物合成及果实发育相关基因的表达分析

摘要

西双版纳黄瓜（Cucumis sativus L. var. xishuangbannanesis）是我国特有的橙黄色果肉黄瓜变种资源，果实中β-胡萝卜素含量是普通栽培变种黄瓜的百倍，并且不同种质间的β-胡萝卜素含量也有明显差异。CsPsy、CsPds、CsZds、CsLcyb、Cschyb和CsZep是类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶基因，其表达水平可能是影响类胡萝卜素积累的重要因素。与普通黄瓜相比，达到生理成熟度的西双版纳黄瓜瓜形呈近圆形或圆柱形，果实最大横径明显大，这可能与数目较多的果实发育基因相关。在本研究中，以西双版纳变种和普通变种黄瓜为主要研究对象，基于前期转录组测序数据，评价并筛选出黄瓜果实生长发育时期表达相对稳定的基因作为内参基因，进而利用实时荧光定量PCR技术，对不同变种黄瓜在果实不同发育时期的胡萝卜素生物合成途径及果实生长发育相关基因的表达量进行检测，了解各基因在表达水平的变化规律，探讨其对β-胡萝卜素大量积累及特异果形的关系，为进一步深入揭示西双版纳黄瓜的优异基因奠定基础。试验主要结果如下：
　　1、基于转录组测序数据，在全基因组范围内筛选了5个表达相对稳定的基因作为候选内参基因，同时选取4个常用内参基因，利用实时荧光定量PCR技术，结合geNorm和NormFinder软件对其在黄瓜果实生长发育时期的表达稳定性进行评价分析。总体数据分析显示，基于转录组测序数据筛选的内参基因在表达水平的稳定性高于传统内参基因。其中泛素结合酶 E2（ Csa4M045000）在不同品种、不同授粉方式及不同果实发育时期的表达量均较稳定，适合在开展黄瓜果实的实时荧光定量检测时作为内参基因。
　　2、利用实时荧光定量PCR技术分析CsPsy、CsPds、CsZds、CsLcyb、CsChyb和CsZep的表达量变化趋势。结果表明，在西双版纳黄瓜 BN4中，各基因的表达量均呈现先上升后下降的趋势，在转色期（授粉后50d左右）达到最大值，分别是普通黄瓜JD7同期表达量的4倍、1.5倍、3倍、3倍、6倍和19倍，该时期两个变种黄瓜果实相关基因的表达量均表现出最大差异。在果实发育中后期，比较不同基因分别在西双版纳黄瓜果实的内果皮（肉色橙黄）和中果皮（肉色黄色）中的表达量，发现在内果皮中CsPsy1的表达水平明显高于中果皮，最高相差约5倍，该基因在普通黄瓜的相同部位比较的表达量变化较小。其它5个基因在两者间的差异也不明显。从以上分析推断，CsPsy、CsZep和CsChyb与其他基因共同调控西双版纳黄瓜的类胡萝卜素合成途径，是在表达水平影响β-胡萝卜素积累的关键基因。
　　3、基于转录组测序数据，筛选获得7类、251个与黄瓜果实生长发育相关的基因，包括细胞周期蛋白相关基因51个、扩张蛋白40个、动蛋白44个等。对上述基因RPKM值的方差分析结果显示，在不同时期表达差异达到显著水平的基因共122个，其中两品种共有的基因59个，仅在BN4中表达差异显著的基因25个，可能与西双版纳黄瓜果形特异等性状有关。在西双版纳黄瓜（BN4）在20d/30d的细胞周期依赖蛋白激酶和类成束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白的上调基因个数较明显多于普通黄瓜（JD7）。对8个基因7个不同时期的实时荧光定量检测结果显示，在果实生长发育期，各基因的表达量基本呈现先上升后下降或持续上升两种趋势。JD7和BN4各基因的变化趋势基本一致，但在微管结合蛋白70-5（MAP70-5）基因（Csa6G511060）中，BN4表达量明显高于JD7。试验结果与转录组数据大致相同，仅在Csa6G078670和Csa6G423400基因中表现出一定差异。

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第一章 引言

1.1 西双版纳黄瓜概述

1.2 类胡萝卜素

1.3 果实发育

1.4 实时荧光定量技术

1.5 内参基因研究进展

第二章 黄瓜果实稳定内参基因的筛选与评价

2.1 材料与方法

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 西双版纳黄瓜β- 胡萝卜素生物合成相关基因的表达分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 黄瓜果实发育相关基因表达分析

4.1 材料与方法

4.2 试验结果

4.3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历