紫花苜蓿维生素E合成基因γ-TMT,HPT和HPPD的分离,遗传转化及功能分析

摘要

紫花苜蓿（Medicago Sativa L.）是异花授粉的同源四倍体且基因组庞大，复杂的遗传背景限制了其有价值基因的发掘和利用。维生素E的合成途径在多个物种中都进行了深入研究，然而关于紫花苜蓿维生素E的合成却鲜有报道。为了提高紫花苜蓿的营养价值，优化紫花苜蓿的维生素E含量和组分，本研究以紫花苜蓿中苜一号（Medicago Sativa L.vs Zhongmu No.1）为材料克隆得到维生素E合成途径的γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT），尿黑酸植基转移酶（HPT）和4-羟苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）并进行研究，取得如下进展：
　　1.以紫花苜蓿叶片为实验材料，采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆得到γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）。进化树分析结果表明，紫花苜蓿MsTMT与截形苜蓿MtTMT高度同源，说明我们成功从紫花苜蓿中克隆得到了γ-TMT并将其命名为 MsTMT。荧光定量PCR分析结果表明，该基因在整株植物中均有表达，其中叶片中表达量最高，花中表达量最低。NaCl、15％PEG、黑暗和脱落酸均可以诱导MsTMT的表达，而低温则抑制MsTMT的表达。转基因拟南芥种子中α-生育酚的含量显著增加，叶片中维生素E的组分和含量则没有变化。同时转基因拟南芥内源维生素E合成基因的表达量均未受到影响。甘露醇处理条件下，转基因拟南芥的发芽率，以及生物量显著高于对照，CAT和POD活性在转基因拟南芥中显著提高，而且渗透胁迫的标志基因的表达量在转基因拟南芥中显著上调，说明转基因拟南芥与对照相比抗逆性增强。转基因紫花苜蓿叶片中α-生育酚和α-生育三烯酚含量以及粗蛋白的含量均有增加，并且在黑暗诱导条件下转基因紫花苜蓿的衰老与对照相比有所延缓。说明MsTMT在不影响紫花苜蓿品质的同时还可以调控转基因紫花苜蓿的叶片衰老过程，因此可以做为紫花苜蓿品质改良的候选基因。
　　2.以紫花苜蓿叶片为实验材料，采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆得到尿黑酸植基转移酶（HPT）的cDNA序列，该基因有一个1236bp的完整开放阅读框，编码411个氨基酸，属于异戊烯转移酶UbiA家族，有异戊烯转移酶HPT1保守结构域。多序列比对分析结果显示，该蛋白与其他物种的HPT高度同源，蛋白序列相似度达80%，由此证明我们成功克隆得到紫花苜蓿HPT基因，并命名为MsHPT。通过染色体步移技术获得1.9Kb启动子序列，序列分析表明，紫花苜蓿MsHPT启动子区域除含有大量的核心启动子元件TATA和CAAT之外，还有脱落酸、乙烯、赤霉素、茉莉酸甲酯等激素反应元件以及大量的与光反应有关的作用元件。实时荧光定量PCR技术分析MsHPT在各组织中的相对表达量，结果表明，MsHPT基因在根、茎、叶中均有表达，叶片中表达量最高。15%PEG，NaCl，赤霉素和脱落酸均可一定程度上诱导该基因的表达。该基因对胁迫的广泛响应，说明该基因可能在紫花苜蓿抗逆性上具有一定的作用。
　　3.以紫花苜蓿叶片为实验材料，采用 cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆得到紫花苜蓿4-羟基丙酮酸转移酶cDNA，cDNA序列分析结果表明，其包含1305bp的开放阅读框，编码434个氨基酸，属于Glo_EDI_BRP_like超家族，在序列的C和N末端各包含一个HPPD结构域，并且C端富含活性位点。多序列比对结果表明，紫花苜蓿HPPD与来自其他物种的HPPD相似性达到82.46%，三个决定该酶活性的铁结合位点在不同的HPPD中高度保守， 因此我们将该基因命名为MsHPPD。实时荧光定量PCR结果表明，MsHPPD在紫花苜蓿的各个组织中均有表达，其中在叶片中表达量最高。通过染色体步移技术获得该基因的启动子序列，并连入pBI121载体中，通过GUS染色分析结果表明，MsHPPD在拟南芥的子叶，主根，萼片，花瓣，柱头，丝管，花粉以及种子果荚的末端都有强烈的GUS表达。真叶，根尖以及下胚轴中没有GUS的表达。NaCl、脱落酸、PEG和黑暗都可以诱导MsHPPD的表达。将该基因转入拟南芥，转基因拟南芥种子中β-生育三烯酚以及维生素E总量含量显著高于对照。且转基因拟南芥种子在正常环境下发芽时间显著早于对照，而在甘露醇和NaCl处理条件下发芽率显著高于对照，并且对ABA处理不敏感。ABA含量测定结果表明，在干种子中ABA的含量在转基因拟南芥和对照中差异不显著，但在浸水36h的种子中，转基因拟南芥ABA的含量显著低于对照。同时，在干种子中，ABA合成基因NCED3,5,9以及ABA信号途径的基因ABI3和ABI5的表达量在转基因拟南芥和对照中表达差异不显著，而浸水后，表达量与对照相比均显著降低。而MsHPPD的表达量在浸水显著升高。将pBI121-MsHPPD-GUS双元表达载体转入紫花苜蓿后，转基因紫花苜蓿叶片中维生素E的含量不变，但是粗蛋白含量与对照相比显著提高。

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第一章 引 言

1． 1 维生素 E 在植物中的合成研究进展

1.2 维生素 E 合成途径的关键酶基因研究进展

1.3 维生素 E 的作用

1.4 研究内容和意义

第二章 γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆及功能分析

2.1 材料和方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 尿黑酸植基转移酶的克隆及表达分析

3.1 实验材料和方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章4-羟基丙酮酸转移酶的克隆及功能分析

4.1 实验方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历