鼠李糖乳酸杆菌LGG来源胞外多糖抑制动物脂肪生成的研究

摘要

人类肥胖症的流行对个人和公共卫生造成的巨大负担以及养殖动物脂肪组织过度蓄积对养殖产业造成的严重经济损失，使得寻找安全有效的控制动物体脂蓄积的活性物质及研究其调控机制迫在眉睫。肠道微生物在调控宿主脂肪积累和代谢过程中有着重要作用。乳酸杆菌作为一种重要的益生菌以及肠道微生物的重要组成部分，成为寻找可以调控脂代谢的菌株和活性物质的重要资源。
　　本研究首先利用前脂肪细胞系3T3-L1作为细胞模型用来筛选和评估乳酸杆菌对脂质代谢的调控作用。对12株具有代表性的乳酸杆菌的菌体提取物的研究发现，所有的菌株均可以显著性地降低成熟3T3-L1细胞内的三酰甘油(TAG)的积累，但是同时也会引起细胞严重的炎症反应。通过对引起炎症因子相关基因表达最弱的一株鼠李糖乳酸杆菌LGG进一步筛选，发现其中结构稳定（耐高温高压）的大分子物质(＞50KD)既可以抑制3T3-L1细胞内脂质的积累，也不引发显著炎症反应。根据乳酸杆菌细胞壁的结构组成，推测这种物质可能是胞外多糖(EPS)。所以首先对LGG的EPS进行了提取纯化并进行了初步的结构鉴定。通过凝胶柱层析色谱得知LGGEPS是一种单一的组分;利用GPC/MALL得知分子量为229，300±0.008 Da; TLC与HPLC的结果表明LGG EPS是由鼠李糖，N-乙酰氨基葡萄糖和半乳糖组成的;还进一步对纯化后的多糖进行了红外光谱和核磁共振的检测。将LGG EPS与3T3-L1细胞互作，结果表明LGG EPS可以抑制细胞内脂滴的积累;并且导致相关脂合成基因表达显著性下调。同时，LGG EPS没有引起细胞的炎症反应。这些结果表明LGG EPS是可以调控脂代谢的大分子生物活性物质。
　　动物试验中，在高脂饲料诱食的斑马鱼中证实了LGG EPS具有抵抗脂肪蓄积的作用。首先使用高脂饲料构建斑马鱼幼鱼和成鱼的肥胖模型。LGG EPS添加到高脂饲料中，以0.5％和1.0％两个剂量配制饲料，按照每天6％体重的采食量投喂4周。结果表明，与对照组相比，通过将LGGEPS添加到饲料中可以改善高脂诱导造成的肥胖和脂肪肝，但LGG EPS在机体中的识别受体，以及其抗肥胖及改善脂肪肝的下游机制还需进一步研究。在高脂诱导的肥胖小鼠上进行了进一步的研究。LGG EPS采用腹腔注射的方式，按照50mg/kg体重的剂量注射2周。结果表明，与对照组相比，LGG EPS处理后小鼠的脂肪组织的重量显著降低，而且脂肪细胞也显著性的变小。肝脏内TAG和CE（胆固醇酯）含量也显著性地下调。血脂水平在经过2周的LGG EPS注射后也显著性下降。另外，LGG EPS注射还可以抑制脂肪组织和肝脏内促炎因子的表达，促进脂肪组织和肝脏内抑炎因子的表达，显示出免疫保护效应。LGG EPS处理后的小鼠的脂肪组织和3T3-L1细胞的TLR2均被显著性地高表达。而且，在3T3-L1内对TLR2进行敲降后，继续使用LGG EPS处理细胞时，对细胞内TAG的含量没有显著影响，这在机制上说明LGG EPS是通过TLR2介导的通路来达到控制脂生成的作用。总之，本研究表明LGG EPS在控制动物体内脂肪蓄积方面具有一定的应用潜力。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1．1 人类肥胖的流行病学

1．1．2 养殖经济动物的体脂蓄积现状

1．1．3 动物体脂过度蓄积的机制

1．2 降低动物体脂蓄积的营养学靶点

1．2．1 脂肪组织

1．2．2 脂肪细胞

1．2．3 脂肪酸的合成与分解

1．2．4 三酰甘油的合成与分解

1．2．5 脂类分子在细胞间的转运过程

1．3 乳酸杆菌在脂代谢中的作用

1．3．1 乳酸杆菌可以调节宿主代谢水平

1．3．2 乳酸杆菌改变肠道微生物的组成

1．3．3 乳酸杆菌降低脂肪蓄积导致的炎症

1．4 乳酸杆菌来源胞外多糖生物学功能研究现状

1．4．1 乳酸杆菌来源胞外多糖的益生效应

1．4．2 乳酸杆菌来源胞外多糖的免疫调控效应

1．4．3 乳酸杆菌来源胞外多糖的抗氧化效应

1．4．4 乳酸杆菌来源胞外多糖的抗肿瘤活性

本研究的目的和意义

2．1．1 实验材料

2．1．2 试验方法

第三章 鼠李糖乳酸杆菌LGG来源胞外多糖抑制脂肪细胞内TAG积累

第一节 筛选具有调控脂肪细胞内TAG积累的乳酸菌菌株

3．1．1 本节引言

3．1．2 实验结果

3．1．3 讨论

3．1．4 结论

第二节 鼠李糖乳酸杆菌LGG胞外多糖提取纯化和结构鉴定

3．2．1 本节引言

3．2．2 实验结果

3．2．3 讨论

3．2．4 结论

第三节 LGG EPS抑制3T3-L1细胞分化降低细胞内TAG积累

3．3．1 本节引言

3．3．2 实验结果

3．3．3 讨论

3．3．4 结论

第四章 饲喂LGG EPS抑制斑马鱼体内脂肪组织的积累

4．1 本章引言

4．2 实验结果

4．2．1 生长期斑马鱼肥胖模型的构建

4．2．2 斑马鱼幼鱼肥胖模型的构建

4．2．3 LGG EPS抑制高脂诱食的斑马鱼体内脂肪的积累

4．3 讨论

4．4 结论

第五章 TLR2介导LGG EPS抑制小鼠体内脂肪组织积累

5．1 本章引言

5．2 实验结果

5．2．1 LGG EPS抑制高脂诱食的C57BL／6J小鼠体内脂肪的积累

5．2．2 LGG EPS抑制高脂诱食的C57BL／6J小鼠肝脏的脂滴积累

5．2．3 TLR2介导LGG EPS与脂肪细胞直接作用调控脂质合成

5．2．4 TLR2以同源二聚体的形式介导LGG EPS抑制脂合成的信号

5．3 讨论

5．4 结论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历