反式激活胰岛素信号调控飞蝗卵滞育

摘要

双翅目果蝇Drosophila melanogaster和蚊子Culex pipiens的成虫滞育，以及麻蝇Sarcophagacrassipalpis的蛹滞育的研究结果证实了胰岛素信号参与滞育调控。胰岛素信号通路中信号分子的酪氨酸磷酸化作用可以调节胰岛素信号，因而蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)和蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的相互协调作用被认为是调节胰岛素信号的重要调控因素。活性氧(ROS)参与酪氨酸激酶受体(RTK)的反式激活过程，抑制PTPs活性，胰岛素受体即属于RTKs，而过氧化物酶PRX5可以清除活性氧。因此，为证实飞蝗中存在PRX5→ROS→PTP1B/PTK→胰岛素信号→滞育的调控路径，我们对飞蝗雌成虫PRX5、PTP1B、PTK基因进行了RNAi，并且使用PTP1B抑制剂PTP1B-IN-1和PTK抑制剂染料木黄酮处理了飞蝗雌成虫，在转录水平和蛋白水平上影响了PTP1B/PTK的表达，观察下游胰岛素信号途径和子代蝗卵滞育的变化，结果表明PRX5、PTP1B负调控胰岛素信号途径，促进滞育诱导条件下蝗卵滞育，PTK激活胰岛素信号途径，抑制滞育诱导条件下蝗卵滞育，证实了飞蝗胰岛素信号参与调控卵滞育，且胰岛素受体存在依赖活性氧的反式激活作用，为更深入理解飞蝗滞育机制提供理论基础，提供新的生物农药靶标位点。具体结果如下:
　　1.干扰飞蝗雌成虫PRX5、PTP1B基因，非滞育条件下，胰岛素信号途径基因IR、IRS、PI3K、Akt转录水平显著增加，蝗卵滞育率均为0;滞育诱导条件下，胰岛素信号途径基因IR、IRS、PI3K、Akt转录水平显著增加，蝗卵滞育率显著降低。
　　2.干扰飞蝗雌成虫PTK基因，非滞育条件下，胰岛素信号途径基因IR、IRS、PI3K、Akt转录水平显著降低，蝗卵滞育率均为0;滞育诱导条件下，胰岛素信号途径基因IR、IRS、PI3K、Akt转录水平显著降低，蝗卵滞育率显著增加。
　　3.PTP1B抑制剂PTP1B-IN-1处理飞蝗雌成虫，非滞育条件下，胰岛素信号途径基因IR、IRS、PI3K、Akt转录水平显著增加，胰岛素受体及受体底物磷酸化水平显著增加，糖原和海藻糖含量均显著增加，甘油三酯、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量显著下降，蝗卵滞育率均为0;滞育诱导条件下，胰岛素信号途径基因IR、IRS、PI3K、Akt转录水平显著增加，胰岛素受体及受体底物磷酸化水平显著增加，海藻糖含量显著增加，糖原含量显著减少，甘油三酯、不饱和脂肪酸含量显著减少，饱和脂肪酸含量显著增加，蝗卵滞育率显著降低。
　　4.PTK抑制剂染料木黄酮处理飞蝗雌成虫，非滞育条件下，胰岛素信号途径基因IR、IRS、PI3K、Akt转录水平显著降低，胰岛素受体及受体底物磷酸化水平显著降低，海藻糖含量显著减少，糖原含量显著增加，甘油三酯、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量均显著减少，蝗卵滞育率为0;滞育诱导条件下，胰岛素信号途径基因IR、IRS、PI3K、 Akt转录水平显著降低，胰岛素受体及受体底物磷酸化水平显著降低，海藻糖含量明显减少，糖原含量明显增加，甘油三酯含量明显增加，饱和脂肪酸含量明显减少，不饱和脂肪酸明显增加，滞育率显著增加。
　　5.PRX5在毕赤酵母GS115中表达得到活性重组蛋白，注射到飞蝗雌成虫中，非滞育条件下蝗卵滞育率均为0，滞育诱导条件下蝗卵滞育率显著增加。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 胰岛素信号途径简介

1．1．1 哺乳动物的胰岛素

1．1．2 昆虫的胰岛素类多肽

1．1．3 胰岛素受体

1．1．4 胰岛素信号通路

1．2 胰岛素信号途径对昆虫生长发育的作用

1．2．1 调节新陈代谢

1．2．2 调节细胞大小和生长

1．2．3 调节昆虫生殖

1．2．4 调节昆虫寿命

1．3 胰岛素信号途径影响昆虫滞育

1．3．1 飞蝗胚胎滞育

1．3．2 胰岛素信号途径与昆虫滞育的关系

1．4 胰岛素信号途径的反式激活

1．4．1 蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸激酶

1．4．2 蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶与胰岛素信号途径关系

1．4．3 酪氨酸激酶受体的反式激活

1．5 过氧化物酶通过调节活性氧浓度调节酪氨酸磷酸酶活性

1．5．1 过氧化物还原酶家族

1．5．2 过氧化物还原酶PRX5的分类和理化特性

1．5．3 过氧化物还原酶PRX5的功能

1．6 胰岛素信号调节滞育昆虫能量代谢

1．6．1 滞育昆虫的能量代谢

1．6．2 胰岛索信号与滞育昆虫物质积累

1．7 本研究的目的与意义

第二章 PRX5、PTP1B、PTK RNAi对飞蝗胰岛素信号途径及卵滞育的影响

2．1 试验材料

2．1．1 供试虫源

2．1．2 主要试剂

2．1．4 引物

2．2 试验方法

2．2．1 提取飞蝗总RNA

2．2．2 克隆飞蝗PRX5、PTP1B、PTK、IR、IRS、PI3K、Akt基因

2．2．3 dsRNA的合成

2．2．4 dsRNA的注射

2．2．5 实时荧光定量PCR

2．2．6 飞蝗滞育率统计

2．3 结果与分析

2．3．3 PRX5、PTP1B、PTK基因组织表达差异

2．3．4 PRX5 RN筒对飞蝗胰岛素信号途径基因转录水平的影响

2．3．5 PTP1B RNAi对飞蝗胰岛素信号途径基因转录水平的影响

2．3．6 PTK RNAi对飞蝗胰岛素信号途径基因转录水平的影响

2．3．7 PRX5基因RNAi对飞蝗滞育率的影响

2．3．8 PTP1B基因RNAi对飞蝗滞育率的影响

2．3．9 PTK基因RNAi对飞蝗滞育率的影响

2．4 讨论

第三章 PTP1B抑制剂对飞蝗胰岛素信号途径及卵滞育的影响

3．1 试验材料

3．1．1 供试虫源

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 飞蝗胚胎观察

3．2．6 飞蝗组织海藻糖含量测定

3．2．7 飞蝗组织糖原含量测定

3．2．8 飞蝗组织甘油三酯含量测定

3．2．9 飞蝗组织饱和脂肪酸含量测定

3．2．10 飞蝗组织不饱和脂肪酸含量测定

3．2．11 飞蝗卵滞育率统计

3．3 结果与分析

3．3．2 PTP1B抑制剂对飞蝗胰岛素信号途径基因转录水平影响

3．3．3 PTP1B抑制剂对飞蝗胰岛索信号途径蛋白磷酸化水平的影响

3．3．4 PTP1B抑制剂对飞蝗卵能量物质储存的影响

3．3．5 PTP1B抑制剂对飞蝗卵滞育率的影响

3．4 讨论

第四章 PTK抑制剂对飞蝗胰岛素信号途径及卵滞育的影响

4．1 试验材料

4．1．1 供试虫源

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 试验方法

4．2．1 飞蝗饲养条件

4．2．2 注射PTK抑制剂

4．2．10 飞蝗卵滞育率统计

4．3 结果与分析

4．3．1 PTK抑制剂染料木黄酮对飞蝗胰岛素信号途径基因转录水平的影响

4．3．2 PTK抑制剂对飞蝗胰岛素信号途径蛋白磷酸化水平的影响

4．3．3 PTK抑制剂对飞蝗卵能量物质储存的影响

4．3．4 PTK抑制剂染料木黄酮对飞蝗卵滞育率的影响

4．4 讨论

第五章 PRX5基因在毕赤酵母GS115表达及活性检测

5．1 试验材料

5．1．1 菌种

5．1．2 培养基

5．1．3 主要仪器

5．2 试验方法

5．2．1 基因序列密码子优化

5．2．2 质粒线性化

5．2．6 PCR筛选阳性克隆

5．2．7 重组酵母的诱导表达

5．2．8 发酵液上清纯化

5．2．9 菌体破碎与纯化

5．2．10 浓缩蛋白

5．2．11 蛋白活性研究

5．3 结果与分析

5．3．2 目的蛋白验证

5．3．3 蛋白功能验证

5．4 讨论

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历