猪树突状细胞Clec8A和XCR1受体靶向免疫方法的初步研究

摘要

树突状细胞(dendritic cells，DCs)是一类专职的抗原递呈细胞，在天然免疫和获得性免疫应答中起重要作用。Clec8A是DC表面C型凝集素受体的一种，Clec8A表达于成熟或未成熟的树突状细胞表面起到识别和捕捉抗原的作用，靶向Clec8A受体的抗原可以促进DC成熟，刺激T淋巴细胞增殖，促使机体产生病原特异性的抗体。XCR1是C型趋化因子相应受体，利用DC表面受体的抗体或配体靶向抗原于DCs可增强抗原递呈效率，增强机体针对该抗原的获得性免疫应答水平。因此，本研究旨在研制猪Clec8A与XCR1受体的单域抗体，研究抗体或配体介导的抗原靶向免疫方法，为抗原靶向性疫苗研究奠定基础。
　　根据已构建的抗DC表面受体Clec8A、XCR1的骆驼单域抗体酵母文库，利用原核表达的Clec8A与XCR1胞外区序列筛选抗Clec8A和XCR1的单域抗体。通过磁珠分选和流式细胞术染色分析，筛选验证抗体文库中表达单域抗体的酵母细胞，免疫磁珠三轮筛选后流式分析Clec8A阳性酵母细胞比例从2.19％上升到30.82％, XCR1阳性酵母细胞比例从0.49％上升到17.19％。从第三轮酵母细胞中挑取40个单克隆诱导培养，流式细胞术染色分析以及测序鉴定最终得到1株酵母细胞能表达抗Clec8A受体的单域抗体，测序鉴定得到该单域抗体的基因序列，通过本研究，在本实验室建立了免疫磁珠和流式筛选单域抗体文库的方法体系，为后续研究奠定了基础。
　　本研究中将猪XCL1与A型FMDV多表位基因融合表达，以探讨其增强免疫的效果。首先设计包含三株A型口蹄疫病毒主要中和表位的抗原A10，将XCL1与A10基因串联表达，得到XA10蛋白，另外，突变XCL1中的两个半胱氨酸与A10串联表达，得到DXAl0蛋白。原核表达的三种重组蛋白乳化成6种疫苗进行猪体免疫实验，攻毒以后单独XA10免疫组保护率80％(4/5)，A10、DXA10添加或不添加CpG佐剂，保护率均为100％(5/5)。试验数据分析得出结论:猪XCL1趋化因子融合表达产物能增强机体细胞免疫应答。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1 口蹄疫概述

1．1．1 FMDV结构特点

1．2 口蹄疫表位疫苗研究进展

1．3 单域抗体的研究进展

1．3．1 单域抗体结构特点

1．3．2 单域抗体在FMD方面的进展

1．4 树突状细胞表面受体

1．4．2 趋化因子受体XCR1及其配体XCL1

1．5 研究目的与意义

第二章 树突状细胞表面受体Clec8A与XCR1单域抗体的筛选

2．1 实验材料

2．1．1 细胞来源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 酵母文库的构建

2．2．2 猪Clec8A受体胞外区基因和XCR1基因原核表达

2．2．3 Clec8A抗原蛋白与XCR1蛋白的生物素标记

2．2．4 酵母文库的复苏

2．2．5 酵母文库的筛选

2．2．6 单域抗体基因的克隆

2．3 实验结果

2．3．2 猪Clec8A胞外区与XCR1原核表达与纯化

2．3．3 Clec8A抗原与XCR1的生物素标记鉴定

2．3．4 酵母菌最佳培养时间与最适诱导时间的确定

2．3．5 酵母文库筛选结果的流式细胞术检测

2．3．6 单域抗体基因的PCR鉴定

2．4 小结讨论

第三章 XCL融合A型口蹄疫表位蛋白疫苗的制备

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 多表位免疫原的设计与合成

3．2．2 三种复合表位蛋白原核表达与纯化

3．2．3 Western Blotting检测重组蛋白免疫原性

3．2．4 抗原疫苗的制备

3．3 实验结果

3．3．1 重组表位蛋白包含的各表位

3．3．2 重组蛋白原核表达的SDS-PAGE鉴定

3．3．3 重组蛋白免疫原性Western Blotting鉴定

3．4 小结讨论

第四章 表位疫苗动物免疫效果评价

4．1 实验材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 实验动物分组与免疫

4．2．3 动物采血

4．2．4 抗A型口蹄疫病毒特异性抗体检测

4．2．5 中和抗体水平检测

4．2．6 外周血CD4+、CD8+淋巴细胞亚群检测

4．2．7 淋巴细胞体外增殖

4．2．9 3ABC非结构蛋白抗体

4．3 实验结果

4．3．1 液相阻断ELISA检测特异性抗体效价

4．3．2 微量中和试验检测中和抗体效价

4．3．3 流式细胞术检测CD4+、CD8+淋巴细胞亚群比例

4．3．4 流式细胞术检测淋巴细胞增殖结果

4．3．5 间接ELISA检测血清中IFN-γ水平

4．3．6 3ABC非结构蛋白抗体

4．3．7 攻毒后动物保护率

4．4 小结讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简介