绵羊痘病毒E3L蛋白与Hela细胞内PKR互作的初步研究

摘要

绵羊痘病毒(Sheeppox virus，SPPV)引起的绵羊痘发病症状和人类的天花很像，又称“羊天花”。目前SPPV的致病机制和机体的免疫机制研究都不清楚。痘病毒的病毒生物学特征及致病机制都主要参考模式病毒痘苗病毒(Vaccinia virus，VACV)。双链RNA蛋白激酶(doublestranded RNA-dependent protein kinase，PKR)是宿主抗病毒通路的关键分子之一，而大量研究表明，痘苗病毒编码的E3L蛋白可通过直接或间接与PKR相互作用并抑制PKR磷酸化。SPPV基因组中存在一个与VACV E3L基因序列高度相似的同源基因，但是关于SPPV K3L基因的研究较少，其具体的功能也尚不清楚。因此，本论文初步研究了SPPV E3L蛋白与宿主PKR的相互作用。首先我们建立分析检测SPPV的基因组的荧光定量的方法，结果表明，该方法具有特异性强、灵敏度高（检测下限为101 copies/μL）、重复性好（组内组间重复性试验的变异系数均小于3％）的特点，可以用于临床样品的检测。然后我们对实验室分离保存的SPPV进行病毒滴度进行了测定，并绘制本研究所使用SPPV一步生长曲线，结果显示，在接种0～12h病毒拷贝数几乎没变化，在12～72h病毒呈对数扩增，84h后进入平台期。通过Western-blot方法检测不同时间点SPPV感染Hela细胞后细胞内PKR及其下游分子的活化水平，结果表明:SPPV感染引起的PKR及其下游分子的活化存在时间依赖性。然后通过免疫共沉淀和细胞中瞬时表达E3L蛋白来研究E3L与PKR的互作关系;为了验证SPPV-E3L蛋白对PKR-eIF2α磷酸化的影响以及关键功能位点的确定，本研究构建了SPPV-E3L、SPPV-mE3L(基于SPPV-E3L在135、168和174位点的定点突变)、VACV-E3L和ORFV-E3L的真核表达载体并在Hela细胞中进行瞬时表达。本研究表明SPPV-E3L蛋白不能抑制Hela细胞中的PKR的磷酸化，135、168和174位3个关键位点的突变可能影响了这一功能。在Hela细胞中瞬时表达VACV-E3L蛋白能提高SPPV的增殖水平。免疫沉淀试验确定4种蛋白都能与PKR有物理相互作用;VACV-E3L、ORFV-E3L和SPPV-mE3L蛋白能够抑制Hela细胞内PKR的磷酸化，而SPPV-E3L蛋白不能抑制PKR磷酸化。瞬时表达VACV-E3L蛋白能够影响SPPV的复制。最后，本论文还利用Crispr/Cas9技术建立PKR基因敲除的Hela细胞系，并获得了PKR基因敲除的Hela细胞株，经测序证实PKR基因翻译提前终止，PKR无功能活性。本研究为进一步深入研究SPPV E3L的生物学功能以及PKR的抗病毒的机制奠定了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 痘病毒毒力基因及免疫逃避机制

1．1．1 K3L蛋白家族

1．1．2 K1L和C7L蛋白家族

1．1．3 BSR蛋白家族

1．1．5 E3L蛋白家族

1．2 IFN信号通路研究进展

1．2．1 IFN类型

1．2．2 IFN信号通路

1．3 基因编辑技术

1．3．1 Crispr／Cas9系统的介绍

1．3．2 Crispr／Cas9技术的应用

1．4 研究目的及展望

第二章 SPPV TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测方法的建立

2．1 试验材料

2．1．1 病毒株与细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 引物和探针的设计与合成

2．2．2 重组质粒标准品的制备

2．2．3 荧光定量PCR反应条件的优化

2．2．4 荧光定量PCR反应标准曲线的绘制

2．2．5 特异性检测

2．2．6 敏感性检测

2．2．7 重复性检测

2．2．8 临床样品检测试验

2．3 试验结果

2．3．1 重组质粒标准品的制备

2．3．2 反应体系的优化

2．3．3 SPPV qPCR检测方法的建立

2．3．4 SPPV qPCR检测方法特异性检测结果

2．3．5 SPPV qPCR检测方法敏感性检测结果

2．3．6 重复性试验结果

2．3．7 SPPV TaqMan-MGB探针荧光定量检测临床样本

2．4 讨论

第三章 SPPV感染Hela细胞对PKR-eIF2α信号通路的影响

3．1 试验材料

3．1．1 毒株和细胞

3．1．2 主要试剂

3．1．3 仪器设备

3．2 试验方法

3．2．1 细胞的复苏与培养

3．2．2 SPPV TCID50的测定

3．2．3 SPPV增殖曲线的测定

3．3 试验结果

3．3．1 SPPV TCID50的测定

3．3．2 SPPV增殖曲线的测定

3．3．3 PKR和eIF2α活化与病毒接种时间呈时间依赖性关系

3．4 讨论

第四章 E3L蛋白与PKR的互作研究

4．1 试验材料

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．2 试验方法

4．2．1 SPPV-E3L蛋白的表达曲水平检测

4．2．2 E3L及其同源基因真核表达载体的构建

4．2．3 E3L及其同源基因的真核表达及检测

4．2．4 E3L及其同源蛋白在Hela细胞内与PKR的物理相互关系

4．2．5 E3L及其同源蛋白对Hela细胞内PKR活化的影响

4．2．6 VACV-E3L蛋白的表达对SPPV的复制的影响

4．3 试验结果

4．3．1 SPPV-E3L蛋白的表达曲线

4．3．2 E3L及其同源基因真核表达载体的构建

4．3．3 E3L及其同源基因的真核表达及检测

4．3．4 E3L及其同源蛋白与PKR的物理相互关系

4．3．5 瞬时表达E3L及其同源蛋白对细胞内PKR磷酸化的影响

4．3．6 VACV-E3L蛋白的表达对SPPV的复制的影响

4．4 讨论

第五章 人源PKR基因敲除Hela细胞株的构建

5．1 试验材料

5．1．1 主要试剂

5．1．2 主要仪器

5．2 试验方法

5．2．1 PKR靶点设计与合成

5．2．2 pHMG-sgRNA载体的构建

5．2．3 sgRNA在Hela细胞中的效率筛选

5．2．4 单细胞克隆的制备

5．3 试验结果

5．3．1 PKR靶点设计与合成

5．3．2 pHMG-sgRNA载体的鉴定

5．3．3 sgRNA在Hela细胞中的打靶效率筛选

5．3．4 PKR基因敲出Hela细胞株的鉴定

5．4 讨论

第六章 全文总结

参考文献

附录

致谢

作者简历