水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

摘要

水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease，AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，ADV)感染引起的一种以浆细胞弥漫性增生和持续性病毒血症为特征的慢性传染性疾病。ADV属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒亚科（Parvovirinae）、阿留申病毒属（Amdovirus）。ADV主要侵害水貂的免疫系统，不仅可导致幼貂大量死亡，还将严重影响成年貂的繁殖力与毛皮质量，给养殖户造成巨大的经济损失，是危害世界水貂养殖业健康发展的重要疫病之一。目前该病既无有效的疫苗，也无特异性的治疗药物，主要防控手段是通过检疫淘汰策略净化种群。因此，建立一种敏感、特异、稳定并且适用于基层样品大规模筛查的诊断方法势在必行。
　　本研究从发病水貂的肝脏组织内分离到一株高致病性ADV，将其命名为ADV-HRB，并完成了该毒株全基因组序列的测定，为ADV的深入研究奠定基础。通过原核表达系统表达了ADV重组VP2蛋白，以此蛋白作为免疫原制备抗ADV的单克隆抗体(Monoclonal antibody, MAb)和兔源多克隆抗体(Polyclonal antibody, PAb)，建立了检测ADV抗原的双抗体夹心ELISA(Double-antibody sandwich ELIS，DAS-ELISA)方法，为基层样品的大规模筛查提供技术支持。具体研究结果如下:
　　1.ADV的分离与鉴定
　　用PCR方法对黑龙江省内的部分水貂养殖场进行抽检，将阳性貂的部分组织加入PBS后研磨，组织研磨液上清除菌后接入CRFK细胞，盲传5代，PCR方法可在每代培养物中检测到病毒，负染后在电镜下可观察到病毒粒子，分离毒株感染BALB/c小鼠后，可在心、肝、脾、肺、肾、肠组织及血清中检测到病毒存在。结果证明分离获得的毒株为ADV强毒株，将其命名为ADV-HRB。
　　2.ADV分离株全序列测定
　　设计多对引物，对ADV-HRB分离株的全基因组进行扩增、克隆、测序与分析，得到了完整的基因组序列，全长4810 bp。通过与国内外分离株的同源比对发现与ADV-BJ株的相似性最高，为探究ADV体外复制与致病性的研究提供了基础。
　　3.ADV重组VP2蛋白的原核表达
　　根据GenBank上已经公布的ADV全序列(JN040434.1)，合成VP2高免疫活性区基因并连接pET-30a(+)载体，重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，获得了融合表达的ADV-VP2包涵体蛋白。将带有His标签的VP2蛋白通过镍柱进行纯化后，采用缓慢透析法复性，Western Blot分析结果表明该蛋白可与ADV阳性血清产生良好的免疫反应。
　　4.ADV单克隆抗体与兔源多克隆抗体的制备
　　利用经过纯化、复性的VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔。取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得了1株IgG亚型的单抗1G5。单抗与兔多抗血清采用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化后，间接ELISA方法检测其效价均在105以上，间接免疫荧光试验(IFA)证明两种抗体和ADV具有良好的免疫反应。
　　5.ADV抗原表位的鉴定
　　将VP2蛋白截短表达为6段，采用Western Blot的方法确定单抗抗原表位的大致范围，再利用合成肽的方法对抗原表位进行精确定位。初步确定单抗1G5识别的线性表位区域为460EEEGWPAASGTHFED474。
　　6.ADV双抗体夹心ELISA检测方法的建立与初步应用
　　以纯化的MAb作为包被抗体，PAb作为检测抗体，棋盘滴定法确定最佳工作浓度分别为10μg/mL和8μg/mL，通过对反应条件的一系列优化，最终建立了ADV的DAS-ELISA检测方法。该方法与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、水貂肠炎病毒均无交叉反应，敏感度2μg/mL，批间、批内变异系数小于10％。利用该方法和PCR方法平行检测102份临床样品，符合率达96.875％。说明该方法具有敏感、特异、稳定、简便等优点，适用于基层进行大规模病原检测。

目录

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摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 水貂阿留申病毒概述

1．1．1 ADV的分类

1．1．2 形态结构与理化性质

1．1．3 ADV的致病机理

1．1．4 ADV的流行病学

1．1．5 ADV的防治

1．1．6 ADV的体外培养

1．2 ADV的分子生物学特性

1．2．3 基因组编码蛋白

1．3 AD诊断方法的研究进展

1．3．1 病原学诊断

1．3．2 血清学诊断

1．3．3 分子生物学诊断

1．4 研究的目的和意义

2．1．1 细胞与实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 样品处理

2．2．2 病毒DNA的提取

2．2．3 PCR方法检测ADV

2．2．4 病毒分离培养

2．2．5 电镜观察

2．5．6 小鼠感染试验

2．3 结果

2．3．1 PCR检测结果

2．3．2 病毒分离与电镜观察结果

2．3．3 小鼠感染试验结果

2．4 讨论

第三章 ADV-HRB毒株全序列测定与分析

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 片段扩增

3．2．3 克隆测序

3．2．4 比对分析

3．3 结果

3．3．1 片段扩增

3．3．2 比对分析

3．4 讨论

4．1 材料

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 重组表达菌构建

4．2．2 重组蛋白诱导表达

4．2．3 重组蛋白SDS-PAGE电泳鉴定

4．2．4 重组蛋白纯化

4．2．5 重组蛋白复性

4．2．6 重组蛋白Western Blot鉴定

4．3 结果

4．3．1 重组蛋白表达

4．3．2 重组蛋白纯化

4．3．3 重组蛋白复性

4．3．4 重组蛋白Western Blot鉴定

4．4 讨论

第五章 ADV单克隆抗体与兔源多克隆抗体的制备

5．1 材料

5．2．1 动物免疫

5．2．2 细胞融合

5．2．3 杂交瘤细胞筛选

5．2．4 杂交瘤细胞亚型鉴定

5．2．5 IFA检测抗体

5．2．6 腹水制备与纯化

5．2．7 抗体效价的测定

5．2．8 抗原表位的鉴定

5．3 结果

5．3．1 单抗亚型

5．3．2 IFA检测抗体

5．3．3 腹水纯化

5．3．4 抗体效价

5．3．5 表位鉴定

5．4 讨论

第六章 ADV双抗体夹心ELSIA检测方法的建立

6．1 材料

6．1．1 病毒与样品来源

6．1．2 主要试剂

6．1．3 主要仪器

6．2 方法

6．2．2 反应条件的优化

6．2．3 判定标准的确定

6．2．4 特异性试验

6．2．5 敏感性试验

6．2．6 重复性试验

6．2．7 符合率试验

6．3 结果

6．3．1 抗体最佳工作浓度

6．3．2 最佳反应条件

6．3．3 判定标准

6．3．4 特异性

6．3．5 敏感性

6．3．6 稳定性

6．4 讨论

第七章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历