米托蒽醌对斑马鱼胚胎的急性毒性作用及其分子机制研究

摘要

抗肿瘤类药物对水生脊椎动物的发育毒性作用日益受到关注，米托蒽醌是一种典型的抗肿瘤类药物，通过抑制DNA复制和RNA转录达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。本研究以盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone hydorehloride，MA)为试验用药，以斑马鱼胚胎为受试材料，检测米托蒽醌对斑马鱼胚胎的发育毒性和器官毒性作用，探究其毒性作用分子机制，为抗肿瘤类药物的发育毒性评价和风险管理提供理论依据。
　　通过斑马鱼（AB品系）胚胎96h急性毒性暴露实验，发现MA对斑马鱼胚胎/幼鱼具有致死效应，其浓度-致死率曲线为典型的S型曲线;根据致死率方程，计算96 h半数致死浓度为880μg/L，表明MA在水体环境中属于剧毒物质;MA的致死效应主要发生在斑马鱼胚胎发育早期(24 hpf内)。
　　MA急性暴露对早期斑马鱼胚胎(＜48 hpf)具有致畸效应。显微成像结果表明，MA诱导斑马鱼胚胎躯干前段弯曲和尾部畸形，如尾部缺失、尾部组织萎缩;组织切片和HE染色实验表明，胚胎尾部组织肌细胞排列松散，细胞边缘模糊，细胞核扩散，肌丝消失;在基因水平上，胚胎早期尾部发育相关基因marksa、marksb、supt5h和ta异常表达。MA急性暴露诱导P53凋亡通路基因apaf1、baxa、bcl2、casp3a和tp53基因表达水平显著上调，表明MA可能通过P53细胞凋亡途径诱导斑马鱼胚胎尾部畸形。
　　MA急性暴露可引发斑马鱼胚胎的肝脏毒性。MA诱导72 hpf斑马鱼胚胎肝脏组织紊乱、结构松散、空泡化和肝细胞肿胀等病理现象。通过底物特异性酶活检测，发现72/96 hpf胚胎SOD和GST的酶活变化和MDA含量变化对MA表现出浓度依赖性，表明MA引起胚胎氧化应激反应和脂质过氧化，可能是导致肝脏毒性的原因之一。
　　MA急性暴露对斑马鱼胚胎产生神经毒性。体视显微镜下统计分析，发现MA抑制24 hpf斑马鱼胚胎自主性抽搐;在基因水平上，100μg/L MA显著抑制24 hpf胚胎神经系统发育相关基因bdnf-v2、gap43、hand2、nkx2.2a-v1、neurog、shha和syn2a的表达，其mRNA表达普遍下调2倍以上。MA急性暴露抑制24 hpf胚胎神经系统发育，特别是抑制神经元生长发育和突触形成。
　　MA暴露导致的细胞凋亡和神经毒性由即刻早期基因介导。根据实时定量PCR数据，发现MA急性毒性暴露导致斑马鱼胚胎DNA损伤，诱导即刻早期基因fos、jun和myc等基因上调表达，对靶基因进行表达调控，进而诱导神经细胞增殖和分化，干扰神经系统发育。jun基因编码产物还通过与DNA相互作用以及激活P53途径，诱导细胞凋亡。
　　非编码RNA参与调控了MA诱导的细胞凋亡和神经毒性作用。RNA-seq和生物信息学分析共筛选得到6456个lncRNA转录本，发现差异表达lncRNA的靶基因富集到细胞凋亡、细胞周期、P53信号通路等KEGG通路，进而影响细胞增殖和细胞凋亡。筛选到32849个斑马鱼胚胎circRNA，在斑马鱼胚胎不同发育阶段，MA诱导的差异表达circRNA的来源基因同时富集到神经活性配体-受体互作通路，表明circRNA可能参与调控MA诱导的机体细胞神经毒性作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 药物和个人护理产品类新型污染物

1．1．1 药物与个人护理产品污染现状

1．1．2 药物与个人护理产品对非靶标动物的毒性作用

1．2 米托蒽醌的非靶标毒性作用研究进展

1．2．1 蒽环类抗肿瘤抗生素的临床应用与市场分析

1．2．2 米托蒽醌的药理作用机制

1．2．3 米托蒽醌的非靶标毒性研究

1．3 斑马鱼胚胎在毒理学研究中的应用

1．3．1 斑马鱼胚胎发育阶段划分

1．3．2 斑马鱼胚胎在毒理学研究中的技术优势

1．3．3 斑马鱼胚胎毒理学研究进展

1．4 本文的研究目的与意义

1．4．1 研究方案与内容

1．4．2 研究目的与意义

第二章 米托蒽醌对斑马鱼胚胎的急性毒性作用

2．1 材料

2．1．1 动物材料

2．1．2 药品试剂

2．1．3 仪器与耗材

2．2 方法

2．2．1 斑马鱼养殖

2．2．2 MA溶液配制与HPLC检测

2．2．5 RNA提取与qPCR

2．2．6 数据统计与分析

2．3 结果

2．3．1 MA的稳定性

2．3．2 MA对斑马鱼胚胎及幼鱼的致死率

2．3．3 MA对斑马鱼胚胎的脱膜率的影响

2．3．4 内参基因筛选

2．3．5 毒性分子标志物表达水平分析

2．4 讨论

2．4．1 MA在光照条件下的稳定性

2．4．2 MA促进斑马鱼胚胎孵化

2．4．3 MA暴露条件下斑马鱼胚胎内参基因稳定性

2．4．4 MA对斑马鱼胚胎早期发育毒性作用

2．5 小结

第三章 米托蒽醌对斑马鱼胚胎的器官毒性作用

3．1 材料

3．1．1 药品试剂

3．1．2 仪器设备

3．2 方法

3．2．1 显微镜观察拍照与计数

3．2．2 组织切片与HE染色

3．2．3 氧化应激酶系酶活检测

3．2．4 RNA提取与qPCR

3．2．5 数据分析

3．3 结果

3．3．1 MA诱导斑马鱼畸形和细胞凋亡

3．3．2 MA的肝脏毒性与氧化应激效应

3．3．3 米托蒽醌的神经毒性与对运动行为的影响

3．4 讨论

3．4．1 MA诱导斑马鱼胚胎早期尾部发育畸形和细胞凋亡

3．4．2 米托蒽醌的肝脏毒性与氧化应激效应

3．4．3 米托蒽醌的神经毒性与对运动行为的影响

3．5 小结

第四章 IEGs介导的细胞凋亡和神经毒性作用通路

4．1 材料

4．2 方法

4．2．1 MA毒性暴露实验

4．2．2 RNA提取与荧光定量PCR

4．2．3 数据分析

4．3 结果

4．3．1 MA诱导DNA损伤与IEGs表达

4．3．2 斑马鱼胚胎对MA的体内转运与转化

4．4 讨论

4．4．1 MA的遗传毒性

4．4．2 IEGs介导的毒性作用信号通路

4．4．3 MA在斑马鱼胚胎体内的转运与转化

4．5 小结

第五章 MA暴露下斑马鱼胚胎非编码RNA表达谱的分析

5．1 材料与方法

5．1．1 胚胎处理与RNA提取

5．1．2 RNA文库构建

5．1．3 上机测序

5．1．4 生物信息学分析

5．2 结果

5．2．1 斑马鱼胚胎lncRNA表达特征分析

5．2．2 差异表达lncRNA分类与靶基因预测

5．2．3 lncRNA调控MA诱导的细胞凋亡和细胞周期

5．2．4 斑马鱼胚胎circRNA表达特征分析

5．2．5 差异表达circRNA筛选与来源基因预测

5．2．6 circRNA调控MA诱导的神经毒性作用与药物转运

5．3 讨论

5．3．1 MA诱导斑马鱼胚胎lncRNA差异表达

5．3．2 MA诱导斑马鱼胚胎circRNA表达

5．4 小结

第六章 全文结论

6．1 研究结论

6．3 研究展望

参考文献

致谢

作者简历