杀虫剂抗、感烟粉虱内生菌群落和乙酰胆碱受体α3亚基的比较分析

摘要

烟粉虱是一种重要的世界性农业害虫，包含26个隐种（此前报道为36种生物型），尤以入侵性的B型[也被称为Middle East Asia Minor1(MEAM1)]和Q型[也被称为Mediterranean(MED)species]在我国和其他地区的危害最为严重。目前烟粉虱的防治主要依赖化学药剂，但近年来烟粉虱已经对许多市售常规杀虫剂，特别是新烟碱类杀虫剂，产生了很强的抗药性。为揭示内共生菌及烟碱型乙酰胆碱受体α3亚基突变在烟粉虱抗性形成中的贡献，本研究选取了如下6个不同的杀虫剂抗、感烟粉虱品系进行试验:对吡虫啉敏感的品系Yuma-04-B-S，对吡虫啉的抗性品系Composite11-B-R（抗性倍数:15600）、08-52-Q-R（抗性倍数:144500）和11-50-WFP-Q-R（抗性倍数:133800），对吡丙醚的敏感品系12-10-Gadsen-B-S，对吡丙醚的抗性品系QC-02-B-R（抗性倍数:25.43）。借助16S rRNA基因测序技术比较分析了烟粉虱B、Q两种生物型以及对保幼激素类似物和新烟碱类杀虫剂的抗、感品系间内共生菌种类及含量的差异，通过RT-PCR技术克隆了Composite11-B-R、Yuma-04-B-S这两个分别对吡虫啉的抗、感品系的烟碱型乙酰胆碱受体α3亚基（新烟碱类杀虫剂的作用靶标）基因的cDNA，通过对序列差异性对比分析，揭示了抗性—共生菌—nAChR之间的的关系，结果如下:
　　采用16S rRNA基因测技术检测了烟粉虱不同品系间内共生菌的种类及含量，并通过对比分，析，发现Candidatus Portiera，Rickettsia和Candidatus Hamiltonella为6个品系中的共有菌属，且含量最多;对Composite11-B-R和08-52-Q-R这两个品系所包含的OTU序列做进行对比分析，发现08-52-Q-R中含有668个Candidatus Nitrososphaera、489个Arthrobacter（节杆菌属）、262个Bacillus（芽孢杆菌属）、154个Wolbachia（沃尔巴克氏属）、113个Pseudomonas（铜绿假单胞菌属）、73个Sphingobium（鞘氨醇单胞菌属）、72个Rubrobacter（红色杆菌属）、53个Jan Thinobacterium(詹森菌属(医)）、53个Sphingobium(鞘脂菌属)，而这些菌属在Composite11-B-R均未检测到;对Composite11-B-R和11-50-WFP-Q-R这两个品系所包含的OTU序列做进行同样的对比分析，在品系11-50-WFP-Q-R中，Arthrobacte（节细菌属）、Candidatus Nitrososphaera、Bacillus（芽孢杆菌属）、Sphingobium（鞘脂菌属）的含量分别为325、281、189、50，在Composite11-B-R同样未检测到以上菌属，故推测以上内共生菌可能与烟粉虱B、Q两种生物型分化有关。
　　内共生菌Rickettsia-OTU10、Candidatus Portiera-OTU85、Candidatus Hamiltonella-OTU324、S24-7-OTU297、[Prevotella]-OTU70、Candidatus Portiera-OTU190在Composite11-B-R中的含量依次为在Yuma-04-B-S中的17.36倍、15倍、3.51倍、3.25倍、3.18、3.0倍，它们可能与烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性形成有关;对12-10-Gadsen-B-S和QC-02-B-R做相同的分析，共生菌含量差异如下:Candidatus Hamiltonella-OTU7（1215倍）、Candidatus Portiera-OTU85（86.67倍）、Candidatus Portiera-OTU5(28倍)、Candidatus Portiera-OTU190(20.8倍)、Rickettsia-OTU4(倍10.95)、Rickettsia-OTU2（10.03倍），推测这几类内共生菌可能与烟粉虱对保幼激素类似物杀虫剂的抗性形成有关。
　　通过RT-PCR技术克隆了Composite11-B-R、Yuma-04-B-S这两个分别对吡虫啉的抗、感品系的烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α3亚基基因的cDNA，共得到3对抗、敏品系的等位基因。通过核苷酸序列及氨基酸序列的对比分析，发现在三对抗、感品系中，共有4处多态性碱基位点，其中A52G、G91A和G152A是抗性和部分敏感品系个体共同拥有的，属于同义突变，只有T1463C这一位点的碱基突变是抗性个体特有的，并且该位点的碱基突变引起了第488位的氨基酸由缬氨酸（Yuma-04-B-S）变为丙氨酸(Composite11-B-R)，推测这一突变可能导致了烟粉虱对吡虫啉的抗药性。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 烟粉虱的概述

1．1．1 烟粉虱的起源、分布

1．1．2 烟粉虱的危害、入侵

1．1．3 烟粉虱抗药性的发生和发展

1．2 烟粉虱抗药性的综合防治

1．2．1 农业防治

1．2．2 物理防治

1．2．3 生物防治

1．2．4 化学防治

1．3 新烟碱类杀虫剂的毒理学

1．4 烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性现状

1．5 抗药性机制的研究

1．6 昆虫内共生菌研究进展

1．6．1 昆虫内共生菌与其宿主之间的关系

1．6．2 16S rRNA基因测序法在研究昆虫内共生菌中的应用

1．7 昆虫乙酰胆碱受体研究进展

1．7．1 烟碱型乙酰胆碱受体(nAChZ)的结构与功能

1．7．2 昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的研究进展

1．7．3 烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的突变与抗药性

1．8 研究目的和研究内容

1．8．1 研究目的

1．8．2 研究内容

第二章 杀虫剂抗、感烟粉虱品系内共生菌群落的差异比较分析

2．1 材料与方法

2．1．1 供试虫源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 烟粉虱总DNA提取

2．1．5 CAPS标记法鉴定烟粉虱生物

2．1．6 烟粉虱成虫毒力测定方法

2．1．7 烟粉虱卵的毒力测定方法

2．1．8 数据分析

2．1．9 烟粉虱内共生菌16S rRNA测序分析

2．2 结果与分析

2．2．1 CAPS标记法鉴定烟粉虱生物型结果

2．2．2 烟粉虱各个品系毒力测定结果

2．2．3 16S rRNA细菌微生物多样性测序数据评估

2．2．4 内共生菌对烟粉虱生物型的影响

2．2．5 内共生菌对烟粉虱抗性的影响

2．3 讨论

第三章 杀虫剂抗、感烟粉虱品系nAChR α3亚基的差异比较

3．1 材料与方法

3．1．1 供试虫源

3．1．2 主要仪器

3．1．3 RNA提取

3．1．4 RNA的检测

3．1．5 RNA纯化及cDNA的合成

3．1．6 PCR扩增

3．1．7 琼脂糖凝胶电泳

3．1．8 PCR产物的纯化(胶回收)

3．1．9 克隆载体的连接

3．1．10 转化

3．1．11 菌液PCR

3．1．12 菌液测序

3．2 结果与分析

3．2．1 烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α3亚基的克隆

3．2．2 进化树分析

3．2．3 烟粉虱nAChR α3亚基序列分析

3．2．4 烟粉虱nAChR α3亚基核苷酸及氨基酸序列比对

3．3 讨论

第四章 全文结论

4．1．1 全文总结

4．1．2 下一步研究计划

参考文献

致谢

作者简历