昆虫烟碱型乙酰胆碱受体的杀虫剂靶标亚基鉴定

摘要

烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)是昆虫中枢神经系统中最重要的神经递质受体，同时也是烟碱类、新烟碱类、多杀菌素类和沙蚕毒素类等杀虫剂的作用靶标。但烟碱型乙酰胆碱受体的组成和杀虫剂对应的靶标亚基还不清楚，不能针对性的研究杀虫剂的选择性和害虫抗药性检测。
　　对烟碱型乙酰胆碱受体的研究有许多方法，如基因分子克隆、基因外源表达、免疫共沉淀等。通过外源表达系统进行受体亚基的表达，从而对受体亚基的组合以及亚基功能区域的定位和药理学特性进行研究是一种体外研究乙酰胆碱受体的重要方法。目前在外源表达系统中只能采取昆虫-脊椎动物杂合nAChRs的表达研究，对昆虫体内nAChRs的天然亚基构成的认识仍有局限，因为这些体外杂合表达的受体并不代表体内真正的存在形式，也并不是任何时候体外表达的功能受体的电流反应都能准确反应杀虫剂的作用情况，这与构建的杂合受体本身密切相关。此外免疫共沉淀是用来研究蛋白质相互作用的传统方式。本实验室前期对褐飞虱内源nAChRs进行免疫共沉淀分析，对内源nAChRs的共聚方式有了一定进展，但是该方法也有不足之处，比如需要制备特异抗体，需要大量的测试样本等，操作繁琐，实验周期长。因此这促使我们寻找新的方法并结合传统的技术来研究昆虫nAChRs的杀虫剂靶标亚基鉴定。
　　为了分析杀虫剂的靶标亚基，本文选取了褐飞虱和美洲大蠊两种昆虫作为材料。褐飞虱是重要水稻害虫，本实验室前期已开展大量体外研究，本文通过免疫共沉淀和结合消除的方式分析褐飞虱nAChRs亚基与杀虫剂的对应关系。美洲大蠊是理想的模式昆虫，其DUM神经元是研究杀虫剂神经靶标的理想细胞模型，因此在美洲大蠊DUM神经元细胞中通过RNAi和膜片钳结合的方式，研究nAChRs亚基与杀虫剂的对应关系。期望通过两种昆虫nAChRs亚基与杀虫剂对应关系的研究，明确相应靶标亚基，为建立受体-杀虫剂相互作用模型奠定基础。
　　本文采用免疫共沉淀和放射性配基结合技术、神经细胞RNAi与膜片钳检测技术进行了昆虫神经系统中新烟碱类杀虫剂吡虫啉nAChRs靶标亚基的研究。利用免疫共沉淀技术发现褐飞虱N1α1、N1α2和N1β1构成内源受体N1α1/N1α2/N1β1，而N1α3、N1α8和N1β1构成内源受体N1α3/N1α8/N1β1;利用不同亚基的特异抗体对褐飞虱头部膜蛋白中的亚基进行逐个免疫消除，证实N1α1/N1α2/N1β1构成吡虫啉低亲和力位点，而N1α3/N1α8/N1β1构成吡虫啉高亲和力位点，明确N1α1、N1α2、N1α3、N1α8和N1β1均为吡虫啉的靶标亚基。采用分子生物学技术克隆了美洲大蠊nAChRs的α1、α2、α8、β1亚基全长序列。采用转染siRNA的方法对美洲大蠊DUM神经元nAChRs的Paα1、Paα2、Paα3、Paα6、Paα8和Paβ1亚基进行了RNA干扰研究，干扰后各亚基的表达量明显下降，达到较为理想的干扰效率。采用膜片钳与RNA干扰结合的方式，研究干扰Paα1、Paα2、Paα3、Paα6、Paα8和Paβ1后美洲大蠊神经细胞的对吡虫啉和乙酰胆碱的药理学特性，分析各个亚基与化合物之间的联系，证实其中Paα1、Paα2、Paα3、Paα8和Paβ1亚基是与吡虫啉特异结合的靶标亚基。
　　一、褐飞虱烟碱型乙酰胆碱受体的内源亚基组成研究
　　将褐飞虱头部提取物与Nb1-Ⅰ进行免疫沉淀反应，所获得的蛋白分别利用Nb1-Ⅰ或N1-Ⅰ，N2-Ⅰ，N3-Ⅰ或者N8-Ⅰ进行免疫印迹分析，均检测到了单一的条带，且均能被相应的融合蛋白N1β1消除。结合本实验前期关于N1α1和N1α2免疫共沉淀、N1α3和N1α8免疫共沉淀的结果，说明褐飞虱N1α1、N1α2和N1β1三个亚基在同一个内源受体中，构成内源受体N1α1/N1α2/N1β1;而N1α3、N1α8和N1β1在另外一个内源受体中，构成内源受体N1α3/N1α8/N1β1，同一个受体中的亚基具有直接的蛋白互作关系。
　　利用不同亚基的特异抗体对褐飞虱头部膜蛋白中的亚基进行逐个免疫消除，能够在[3H]标记的吡虫啉结合实验中产生一个剂量依赖的降低曲线。利用N1α1和N1α2特异性抗体进行免疫消除后，[3H]标记吡虫啉的结合效率降低了大约67％(N1-Ⅰ为66.3±7.3％;N2-Ⅰ为67.6±5.9％)，同时低亲和力位点消失。利用N1α3和N1α8特异性抗体进行免疫消除后，[3H]标记的吡虫啉的结合效率降低了大约33％（N3-Ⅰ为32.5±4.1％;N8-Ⅰ为33.3±3.6％），同时高亲和力位点消失。当利用特异性抗体Nb1-Ⅰ对N1β1亚基进行免疫消除后，可以完全消除[3H]标记的吡虫啉的结合位点;利用其他亚基N1α4、N1α6、N1α7或N1b2的特异性抗体（N4-Ⅰ、N6-Ⅰ、N7-Ⅰ或Nb2-Ⅰ）进行消除后，对[3H]标记的吡虫啉的结合效率并没有明显的影响。这些结果说明N1α1/N1α2/N1β1构成吡虫啉低亲和力位点（Kd=1.5±0.2nM），而N1α3/N1α8/N1β1构成吡虫啉高亲和力位点（Kd=3.5±0.6pM）。同时结果表明，N1α1、N1α2、N1α3、N1α8和N1β1均为吡虫啉的靶标亚基。
　　二、美洲大蠊烟碱型乙酰胆碱受体α1、α2、α8、β1亚基基因的克隆
　　烟碱型乙酰胆碱受体的基因克隆是研究其性质和组成的重要组成部分，能够为以后的免疫沉淀、体外表达、RNA干扰等实验提供良好的基础。目前美洲大蠊nAChRs的基因序列并不完整，已克隆得到的只有α3、α4、α6、α7，因此本章利用其他昆虫nAChRs亚基序列的同源性比对，首先设计了简并引物，PCR克隆出了部分片段，然后结合RACE技术，克隆出美洲大蠊nAChRs的α1、α2、α8、β1亚基的基因全长。Paα1基因全长2536bp，其开放阅读框为1662bp，编码554个氨基酸，GeneBank登录号为:JF784150.1。Paα2基因全长2691bp，其开放阅读框为2055bp，编码685个氨基酸，GeneBank登录号为:JF784151.1。Paα8基因全长3011bp，其开放阅读框为1767bp，编码589个氨基酸，GeneBank登录号为JF784153.1。Paβ1基因全长2379bp，其开放阅读框为1632bp，编码544个氨基酸，GeneBank登录号为:JF784154.1。4个亚基基因结构特征分析也显示，它们均具有nAChRs亚基的典型特征，如α亚基均具有典型的双半胱氨酸结构、4个跨膜片段，氨基酸残基形成的环（α亚基有LoopA-C环，β亚基有LoopD-F环）及两个糖基化位点等。经过序列比对和同源性分析，从美洲大蠊中克隆的α1、α2、α8、β1亚基与已报道的昆虫nAChRs相应亚基具有很高的同源性。这说明本研究克隆的4个亚基均为美洲大蠊的nAChRs亚基基因。结合同源性比对和系统进化关系，分别将克隆出的美洲大蠊nAChR亚基命名为Paα1、Paα2、Paα8、Paβ1。
　　三、美洲大蠊神经细胞的RNA干扰研究
　　RNA干扰是一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。在昆虫领域，RNAi技术主要用于研究昆虫功能基因和功能基因组等方面，并已在包括鞘翅目、半翅目、直翅目、蜚蠊目等19种昆虫中取得成功。但是目前RNA干扰广泛利用的注射法和饲喂法存在一些不足之处，比如干扰效率不高，容易对虫体产生损伤等，这促使我们寻找效果更好的方法。美洲大蠊的DUM神经元易于分离培养，目前已证实其细胞膜上表达钾离子通道、电压依赖的钠离子通道、钙离子通道、氯离子通道、乙酰胆碱受体、谷氨酸受体等多种离子通道和受体，是研究杀虫剂神经毒性和昆虫抗性的理想细胞模型。
　　本章根据Paα1、Paα2、Paα3、Paα6、Paα8和Paβ1的基因序列设计合成了相应的特异siRNA，将其转染入神经细胞后，通过荧光定量PCR检测其在12小时和24小时后的干扰效率。定量结果得出，这6个亚基在12小时和24小时表达量均有下调。其在12小时的对应的干扰效率分别是36.1％、24.3％、18.7％、28.9％、31.4％和25.3％，;在24小时的对应的干扰效率分别为62.4％、49.6％、42.8％、64.5％、68.3％和55.4％。通过分析我们发现，各亚基的mRNA的表达量在12小时已经有所降低，但并不足以用于分析研究，在24小时后能够达到较低的表达水平。其中，Paβ1和Paα8是干扰24小时后表达量最低的两个亚基，只有对照表达量的三分之一左右。总的来说24小时干扰后，各亚基均能达到较为理想的干扰效率，可以用来进行后续的进一步研究。综上所述通过此体系可以有效的干扰美洲大蠊nAChRs各个亚基的表达水平。此套RNA干扰方法的建立，有利于今后使用siRNA对美洲大蠊DUM神经元中各种基因的表达进行干扰，来研究各个基因的功能。在接下来的实验中还可以采取与电生理技术结合的方式，来研究美洲大蠊nAChRs亚基组成及其药理学特性，有利于明确鉴定杀虫剂靶标亚基，为以后阐明各个nAChRs基因的功能提供了一个新的角度，从而为新农药选择性的开发和抗药性亚基检测提供理论依据。
　　四、美洲大蠊神经细胞RNA干扰后的电生理研究
　　本章利用RNAi技术干扰了美洲大蠊DUM神经元nAChRs的Paα1、Paα2、Paα3、Paα6、Paα8和Paβ1亚基的表达，结合膜片钳技术记录神经元的干扰组和对照组上吡虫啉和乙酰胆碱的诱导电流，并计算其EC50和Imax值。研究结果证实，吡虫啉在作用于分别干扰Paα1、Paα2、Paα3和Paα8亚基的神经元时，EC50有显著变化，这证实了Paα1、Paα2、Paα3和Paα8亚基是nAChR中吡虫啉特异结合的靶标亚基;干扰Paβ1亚基后，对吡虫啉和乙酰胆碱的Imax有显著性影响，说明Paβ1是nAChR中形成功能受体重要的组成部分，也是吡虫啉的重要靶标位点。此套RNA干扰和电生理结合的方法使我们明确鉴定了杀虫剂靶标亚基，为以后阐明各个nAChRs亚基的功能研究提供了一个新的思路。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 烟碱型乙酰胆碱受体的结构和组成

1．1 烟碱型乙酰胆碱受体结构

1．2 烟碱型乙酰胆碱受体的组成

2 昆虫乙酰胆碱受体细胞水平上的研究进展

2．1 昆虫细胞培养和研究现状

2．2 昆虫神经细胞研究进展

2．3 利用昆虫神经细胞研究乙酰胆碱受体的进展

3 昆虫RNA干扰的研究进展

3．1 RNAi的作用机制

3．2 siRNA的合成与制备

3．3 昆虫RNAi的方法和应用

3．4 昆虫细胞RNAi研究进展

4 研究的目的与意义

第二章 褐飞虱中新烟碱类杀虫剂靶标亚基研究

1 材料与方法

1．1 供试化合物

1．2 免疫共沉淀

1．3 放射性配基结合

1．4 数据分析

2 结果与分析

2．1 褐飞虱内源nAChRs亚基的免疫共沉淀

2．2 放射性配基结合实验

2．3 免疫消除后的去垢剂提取物放射性配基结合实验

3 讨论

第三章 美洲大蠊烟碱型乙酰胆碱受体α1、α2、α8、β1亚基基因的克隆

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 主要试剂

1．3 总RNA提取及cDNA模板合成

1．4 PCR引物设计

1．5 美洲大蠊烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因的克隆

2 结果与分析

2．1 美洲大蠊烟碱型乙酰胆碱受体亚基的克隆和测序

2．2 美洲大蠊烟碱型乙酰胆碱受体亚基全长序列分析

2．3 美洲大蠊烟碱型乙酰胆碱受体亚基的同源性分析

3 讨论

第四章 美洲大蠊神经细胞的RNA干扰研究

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 试剂与溶液

1．3 仪器

1．4 美洲大蠊DUM神经元的分离

1．5 DUM神经元的siRNA转染

1．6 美洲大蠊DUM神经元RNA的提取

1．7 RNA反转录成cDNA

1．8 实时荧光定量PCR检测

2 结果与分析

2．1 转染效率的检测

2．2 PCR产物熔解曲线及荧光定量PCR扩增效率分析

2．3 不同干扰时间RNA干扰的效率分析

3 讨论

第五章 美洲大蠊DUM神经元RNA干扰后的电生理研究

1 材料与方法

1．1 供试细胞

1．2 实验试剂

1．3 膜片钳全细胞记录

1．4 数据处理

2 结果与分析

2．1 吡虫啉对干扰后美洲大蠊DUM神经元的作用

2．2 乙酰胆碱对干扰后美洲大蠊DUM神经元的作用

3 讨论

全文总结

参考文献

附录Ⅰ 攻读学位期间发表的论文

附录Ⅱ 攻读学位期间获得的奖励

致谢