花鲈利用鱼粉和植物蛋白源的选择性摄食调控机制研究

摘要

对植物蛋白饲料的厌食现象是肉食性鱼类对鱼粉依赖性较强的主要原因。与哺乳动物相同，鱼类摄食行为受外周和中枢摄食信号系统调控，主要调控因子的功能也基本一致，但鱼类对植物蛋白源饲料的主动性选择和回避的关键原因及调控机制尚不明确。本论文以典型肉食性鱼类花鲈为研究对象，探究植物蛋白源替代鱼粉对花鲈生长性能和摄食调控机制的影响。以混合植物蛋白（棉籽浓缩蛋白和大豆浓缩蛋白）替代50％、100％低温干燥鱼粉，设计等氮等能的三种饲料，并以DL-Met，Lys-HCl和L-Thr平衡植物蛋白组中的限制性氨基酸，分别命名为FM、PPB50、PPB100。初始体重为（12.97±0.03）g的花鲈随机被分为60桶，每桶25尾，每天严格在8:00和20:00饱食投喂2次，养殖周期为12周。其中每个处理中的4个重复（共12桶）每天计算日摄食量并在4周、8周、12周后进行称重，统计生长指标（长期摄食试验）。其余用于短期摄食试验采样，并分别在3天、2周、4周的餐后3h、6h、24h进行血浆和胃、下丘脑组织样品的采集。12周长期摄食试验结束后，每桶随机选取3尾鱼，采集与短期试验同样的样本，并对剩下的鱼进行3周禁食和3周恢复摄食试验，且分别在饥饿3周后、恢复摄食第1餐和第3周的餐后3h、6h、24h进行样品采集。
　　结果表明:与鱼粉组相比，采用混合植物蛋白替代50％鱼粉后，对花鲈生长性能和形体指标没有显著影响。但混合植物蛋白完全替代后在短期内引起花鲈明显的厌食现象，4周内PPB100组摄食率(FR)显著低于FM组(P＜0.05);5-8周，花鲈已经适应植物蛋白，PPB100组FR显著高于FM组(P＜0.05)，但增重率(WG)仍低于FM组;9-12周，PPB100组持续保持旺盛的食欲，此阶段其FR和WG均显著高于FM组(P＜0.05)。即花鲈摄食完全植物蛋白饲料后，会出现抑制摄食到适应再到补偿摄食的行为。
　　对FM和PPB100组（简称PPB）花鲈在不同摄食阶段（厌食，适应，补偿，人为禁食，恢复摄食）的下丘脑和胃组织样品进行摄食调控通路ghrelin/leptin-mTOR/S6K1-NPY/AgRP/POMC相关基因mRNA水平相对表达量、蛋白磷酸化水平及血浆血糖、神经肽、激素含量的比较研究。结果表明:花鲈摄食完全植物蛋白饲料3天时血糖在餐后0h，3h，6h，24h无差异，而摄食鱼粉组在3h和6h存在血糖高峰，进一步表明花鲈3天时处于极端厌食阶段。空腹状态下，PPB组胃中ghrelin mRNA表达增加而leptin表达降低显示机体处于能量负平衡（饥饿状态），分别与下丘脑中相应的受体GHSR和LEPR结合之后，作用于中枢神经系统能量感受器mTOR。虽然此时机体处于饥饿状态，但下丘脑mTOR mRNA表达及蛋白磷酸化表达水平上调，进一步抑制下游靶蛋白S6K1的蛋白磷酸化，从而下调促食欲肽AgRP和上调抑制食欲因子POMC，由此可见中枢摄食调控系统（mTOR-S6K1-AgRP/POMC）对外周饥饿状态（ghrelin/leptin）缺乏有效响应，是导致花鲈厌食的主要原因。相似的结果在血浆中得到证实，空腹状态时PPB组血浆ghrelin含量显著高于FM组(P＜0.05)，而中枢神经食欲肽NPY无显著差异。厌食状态持续到2周后花鲈开始逐渐适应完全植物蛋白饲料，4周后花鲈下丘脑促食欲肽AgRP mRNA表达水平出现反转，PPB组显著高于FM组(P＜0.05)，表明摄食植物蛋白饲料的花鲈此阶段处于积极素食状态，已经完全适应植物蛋白饲料。12周餐后24h，PPB组血浆ghrelin含量显著低于FM组(P＜0.05)，同时leptin含量显著高于FM组(P＜0.05)，表明此时相比FM组，PPB组饥饿程度更低，但是中枢神经系统抑食因子POMC的显著下调是此阶段产生补偿摄食的主要原因。
　　人为禁食和恢复摄食试验结果表明一旦花鲈适应植物蛋白饲料，无论禁食阶段还是恢复摄食阶段，中枢神经系统摄食调控基因表达保持与外周饥饿状态一致。进一步对比研究发现，由植物蛋白饲料替代鱼粉引起的花鲈主动选择性摄食抑制与人为禁食处理导致的被动摄食抑制存在不同的调控机制:3d-3h时（厌食阶段）抑制食欲因子leptin，mTOR，POMC显著高于饥饿3周(s3w)(P＜0.05)，而促食欲肽AgRP显著下调(P＜0.05)，与花鲈表观摄食行为表现出的3d时极端厌食和s3w时积极索食状态相一致。
　　因此，花鲈对植物蛋白源饲料存在适应能力，ghrelin/leptin-mTOR-S6K1-AgRP/POMC摄食信号通路能够有效的调控肉食性鱼类摄食植物蛋白后由厌食到适应再到补偿生长的摄食行为，对耐高植物蛋白养殖鱼类基因靶向育种，有效提高肉食性鱼类利用植物蛋白能力具有重要意义。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 鱼粉替代的背景及替代蛋白源研究概况

1．2 花鲈饲料中植物蛋白替代鱼粉的研究进展

1．3 鱼类的选择性摄食

1．4 Ghrelin／Leptin-mTOR-S6K1-NPY／AgRP／POMC摄食调控信号通路

1．4．1 外周ghrelin／leptin信号与能量感知

1．4．2 中枢神经系统mTOR-S6K1-NPY／AgRP／POMC摄食调控信号通路

1．5 研究的目的和意义

1．6 技术路线

第二章 混合植物蛋白替代鱼粉对花鲈摄食、生长性能的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 试验饲料

2．1．2 养殖管理

2．1．3 样品采集及检测指标

2．1．4 数据统计与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 混合植物蛋白替代鱼粉对花鲈摄食和生长性能的影响

2．2．2 混合植物蛋白替代鱼粉对花鲈形体指标的影响

2．2．3 混合植物蛋白替代鱼粉对花鲈全鱼常规组分的影响

2．2．4 混合植物蛋白替代鱼粉对花鲈肌肉游离氨基酸的影响

2．2．5 混合植物蛋白替代鱼粉对花鲈肝脏和后肠组织形态学的影响

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 混合植物蛋白完全替代鱼粉对花鲈摄食调控通路的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验饲料

3．1．2 养殖管理

3．1．3 样本采集

3．1．4 血浆中葡萄糖以及摄食相关激素的检测方法

3，1．5 摄食调控通路基因的mRNA表达量的测定

3．1．6 摄食调控通路基因的蛋白磷酸化水平的测定

3．1．7 数据统计与分析

3．2 结果与分析

3．2．1 混合植物蛋白完全替代鱼粉对花鲈血浆血糖和摄食相关激素的影响

3．2．2 混合植物蛋白完全替代鱼粉对花鲈外周摄食调控因子ghrelin和leptin表达量的影响

3．2．3 混合植物蛋白完全替代鱼粉对花鲈中枢神经系统GHSR和LEPR基因表达量的影响

3．2．4 混合植物蛋白完全替代鱼粉对花鲈中枢神经系统mTOR-S6K1-NPY／AgRP／POMC摄食调控通路基因表达量的影响

3．2．5 混合植物蛋白完全替代鱼粉对花鲈摄食调控通路基因的蛋白磷酸化水平的影响

3．3 讨论

3．3．1 Ghrelin／leptin-mTOR-S6K1-NPY／AgRP／POMC通路中摄食调控因子在花鲈中具有中度保守性

3．3．2 中枢摄食神经系统对外周饥饿状态缺乏有效的响应是摄食植物蛋白后花鲈厌食症的主要原因

3．3．3 中枢摄食神经系统旺盛的食欲状态是摄食植物蛋白后花鲈产生补偿摄食的主要原因

3．4 结论

第四章 花鲈主动性摄食抑制与被动性摄食抑制调控模式的差异研究

4．1 材料与方法

4．1．1 试验饲料

4．1．2 养殖管理及样品采集

4．1．3 血浆中葡萄糖以及摄食相关激素的检测方法

4．1．4 摄食调控通路基因的mRNA表达量的测定

4．1．5 摄食调控通路基因的蛋白磷酸化水平的测定

4．1．6 数据统计与分析

4．2 结果与分析

4．2．1 混合植物蛋白完全替代鱼粉对饥饿时期花鲈血浆摄食相关激素水平的影响

4．2．2 混合植物蛋白完全替代鱼粉对恢复摄食时期花鲈血浆摄食相关激素水平的影响

4．2．3 混合植物蛋白完全替代鱼粉对饥饿时期花鲈摄食调控通路基因的mRNA表达量的影响

4．2．4 混合植物蛋白完全替代鱼粉对恢复摄食时期花鲈摄食调控通路基因的mRNA表达量的影响

4．2．5 混合植物蛋白完全替代鱼粉后对花鲈饥饿和恢复摄食时期调控通路基因的mRNA表达差异研究

4．2．6 混合植物蛋白完全替代鱼粉后花鲈主动性摄食抑制和被动性摄食的差异研究

4．3 讨论

4．3．1 花鲈摄食植物蛋白饲料在长期禁食期间对饥饿的耐受性更高

4．3．2 恢复摄食阶段产生的补偿摄食主要依赖于促摄因子ghrelin和AgRP，而不是抑食因子

4．3．3 花鲈摄食植物蛋白饲料后引起的主动选择性摄食抑制与人为禁食处理导致的被动摄食抑制的调控机制不同

4．4 结论

第五章 全文结论

6．1 创新点

6．2 下一步研究方向

参考文献

致谢

作者简历