猪带绦虫Ddi1-like基因功能与其小分子抑制剂药物可用性研究

摘要

寄生蠕虫严重影响人类健康和养殖业的发展，且与HIV等引起的免疫抑制疾病存在广泛的共感染。现今蠕虫病或HIV-蠕虫共感染的治疗手段有限，且存在严重的药物互作和副作用。DNA损伤诱导蛋白1样蛋白（DNA damage-inducible protein1 like protein，Ddi1-like），与HIV蛋白酶同属于反转录型天冬氨酸蛋白酶。该类蛋白在真核生物上具有重要的作用，已证明作为HIV蛋白酶抑制剂(HIVPIs)的靶标用于HIV与原虫共感染的治疗。我们前期的研究证明绦虫和吸虫基因组中存在唯一的Ddi-like蛋白编码基因。本研究以猪带绦虫Ddi-like(TsDdi1-like)为研究对象，进行了基因克隆、真核表达及功能研究，验证TsDdi1-like是否为HIVPIs的靶标，并明确HIVPIs对绦虫的抑制效果，探讨HIVPIs作为治疗绦虫的新型药物及单一药物治疗HIV与蠕虫共感染的可能性。现取得以下结果:
　　1.参考基因组注释信息，设计5'和3'端特异性引物，利用cDNA末端快速扩增(RACE)获得TsDdi1-like基因全长cDNA序列。对该序列进行相关生物信息学分析。结果表明TsDdi1-like基因ORF序列大小为1173bp，可编码390个氨基酸，包含反转录天冬氨酸蛋白结构域(RVP)和泛素化样结构域(UBA)。
　　2.构建了毕赤酵母真核表达重组质粒pPIC9K-TsDdi1-like，经甲醇诱导，获得重组蛋白TsDdi1-like，其分子量大小为55kD。酶动力学实验证明，TsDdi1-like在此条件下不具有水解活性，不能降解荧光底物RE-(EDANS)-SQNYPIVQK-(DABCYL)-R和Bz-RGFFL-4MβNA，与大多数Ddi1同源蛋白一致。
　　3.利用TsDdi1-like蛋白特异性合成肽序列和真核表达获得的纯化重组蛋白分别免疫家兔，4次免疫后获得两种效价均达到1∶12800的多克隆抗体。经Wsetern-blotting检测两种抗体均具有很高的特异性，证明了该蛋白抗体不与其他蛋白发生免疫交叉反应。免疫组化结果表明，两种抗体具有相同的定位结果，TsDdi1-like在猪带绦虫的头节各个部位均有表达，成弥散性分布，TsDdi1-like可能具有重要的基础生理作用，与组成型的转录情况相符。
　　4.利用酿酒酵母Ddi1基因缺失株16141进行基因回补试验，证明TsDdi1-like可以影响酿酒酵母4742株蛋白分泌，小分子抑制剂试验证明， HIVPIs可有效抑制TsDdi1-like蛋白活性，TsDdi1-like是HIVPIs的靶标分子;同时利用原头节与HIVPIs共培养，证明HIVPIs在体外可显著抑制原头节的活性，导致死亡。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1．1 猪带绦虫及猪带绦虫病

1．1．2 猪囊尾蚴病免疫学诊断及治疗研究

1．1．3 HIV与蠕虫共感染及潜在治疗药物

1．2 天冬氨酸蛋白酶概述

1．2．1 蛋白酶及其分类

1．2．2 DNA诱导损伤1样蛋白功能及结构

1．2．3 天冬氨酸蛋白酶抑制剂

1．3 研究目的与意义

第二章 TsDdi1-like基因的克隆及序列分析

2．1 材料与方法

2．1．1 虫体

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 猪带绦虫成虫节片总RNA的提取

2．1．5 cDNA合成

2．1．7 TsDdi1-like蛋白基因的序列分析

2．2 结果

2．2．1 总RNA的提取

2．2．3 TsDdi1-like的序列分析

2．3 讨论

第三章 TsDdi1-like蛋白真核表达及酶活性测定

3．1 材料与方法

3．1．1 载体和菌株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．5 重组质粒pPIC9K-TsDdi1-like线性化与感受态细胞制备

3．1．6 电转化与菌落筛选

3．1．10 rTsDdi1-like酶活力实验

3．3 结果

3．3．3 TsDdi1-like重组蛋白纯化

3．3．4 TsDdi1-like重组蛋白的酶活测定结果

3．4 讨论

第四章 TsDdi1-like的组织定位

4．1 材料与方法

4．1．1 实验动物、载体及菌株

4．1．2 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．1．4 免疫效价测定

4．1．5 抗体纯化

4．1．6 抗体特异性检测

4．1．7 组织定位

4．2 结果

4．2．1 TsDdi1-like重组蛋白的免疫血清效价测定

4．2．2 抗体特异性检测

4．2．3 TsDdi1-like在猪带绦虫成虫头节中的定位

4．3 讨论

第五章 HIVPIs对TsDdi1-like蛋白活力抑制效果

5．1 材料与试剂

5．1．1 菌株与载体

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．2 TsDdi1-like基因扩增与点突变

5．2．3 酿酒酵母感受态细胞制备

5．2．4 电转化与阳性菌落筛选

5．2．5 重组酵母株体外培养及分泌蛋白测定

5．2．6 HIV蛋白酶抑制剂与重组酵母株共培养及分泌蛋白测定

5．2．7 多房棘球蚴体外药物抑制

5．3 结果

5．3．1 TsDdi1-like基因扩增

5．3．2 重组酿酒酵母阳性菌落菌液PCR

5．3．3 重组酵母株外源蛋白分泌aaaa

5．3．4 HIV蛋白酶抑制剂对重组酵母株蛋白分泌的影响

5．3．5 原头节药物抑制效果

5．4 讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历