绿盲蝽四个触角特异气味结合蛋白配体结合特征研究

摘要

转Bt基因棉花的在我国大范围种植显著提高了棉田治理水平，减少了农药使用量，棉铃虫得到了有效的控制，但同时棉田次要害虫绿盲蝽(A.lucorum)数量急剧增加，为害多种经济作物。绿盲蝽嗅觉系统在其寻找寄主、交配及趋避行为中发挥重要作用，深入研究绿盲蝽嗅觉系统对设计绿盲蝽行为调控剂具有重要指导意义。气味结合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)在嗅觉系统中发挥关键作用，进一步研究绿盲蝽OBPs的气味识别谱对深入解析绿盲蝽嗅觉系统具有重要意义，并可以对绿盲蝽的防控提供新的思路。本实验室前期在绿盲蝽鉴定类38个OBPs，本文系统研究了4个触角特异表达的AlucOBPs(AlucOBP14、AlucOBP21、AlucOBP22、AlucOBP24)的配体结合特征，主要内容如下:
　　对4个触角特异表达AlucOBPs进行了克隆、表达和纯化，得到的4个AlucOBPs重组蛋白。利用荧光竞争结合试验研究了4个重组蛋白与68种配体化合物的结合特征，候选配体化合物包括潜在的性信息素及性信息素类似物、萜烯类化合物以及绿叶挥发物。结果发现，AlucOBP14与β-紫罗兰酮，己酸己酯，丁酸辛酯，十二醛能够有效结合。AlucOBP21能够与β-紫罗兰酮，β-石竹烯有效结合。AlucOBP22能与β-紫罗兰酮，β-石竹烯，己酸己酯，丁酸辛酯有效结合。AlucOBP24与β-紫罗兰酮，β-蒎烯有效结合。表明，4个AlucOBPs在绿盲蝽嗅觉系统中发挥重要作用，其中AlucOBP14，AlucOBP22能与性信息素类似物己酸己酯结合，推测这两种AlucOBPs可能同时发挥性信息素结合蛋白和普通气味化合物结合蛋白的双重作用。4个重组AlucOBPs都能与β-紫罗兰酮结合，表明β-紫罗兰酮是AlucOBPs的重要识别配体。另外，利用微量热涌动(MST)技术对AlucOBP21进行了平行功能分析，其结合结果基本与荧光竞争结合试验一致，另外相对于荧光竞争结合试验，MST技术测得的结合谱更加广泛，结合解离常数更小更加灵敏。
　　利用同源建模和分子对接技术对AlucOBP22的结构和关键功能位点进行分析。以蚜虫MvicOBP3(4Z39)为模板构建AlucOB22三维结构，利用建模的结构与β-紫罗兰酮，β-石竹烯，己酸己酯，丁酸辛酯进行分子对接试验，寻找关键结合位点。结果表明，6个位点3Asp、5Leu、40Ile、41Met、44Val和45Met可能在与这4个配体小分子结合过程中起到关键作用。定点突变试验发现，两个位点5Leu，44Val突变之后，突变体失去了对β-石竹烯，己酸己酯，丁酸辛酯的结合能力，但仍然保留了对β-紫罗兰酮的结合能力，这可能与β-紫罗兰酮特有结构有关。综合表明5Leu，44Val是AlucOBP22分子的关键作用位点。

目录

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摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 昆虫嗅觉感器

1．2 昆虫嗅觉识别机制

1．3 气味结合蛋白与小分子化合物结合作用研究方法

1．4 同源模建

1．5 分子对接

第二章 四个绿盲蝽触角特异气味结合蛋白的重组表达及荧光竞争结合试验

2．1 材料与方法

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 供试试剂及仪器

2．1．3 绿盲蝽触角取样及总RNA的提取

2．1．4 表达载体构建

2．1．5 气味结合蛋白的表达和纯化

2．1．6 荧光竞争结合试验

2．2 结果与分析

2．2．1 AlucOBPs重组蛋白质表达纯化结果

2．2．2 荧光竞争结合试验结果

2．3 本章讨论

第三章 绿盲蝽触角特异气味结合蛋白结合特性的MST验证

3．1 材料与方法

3．1．1 供试试剂及仪器

3．1．2 AlucOBP21重组蛋白荧光标记

3．1．3 配体标样配制

3．1．3 微量热泳动试验

3．2 MST结果

3．3 MST结果讨论

第四章 AlucOBP22同源建模、分子对接及定点突变试验

4．1 材料与方法

4．1．1 AlucOBP22同源建模与模型评估

4．1．2 分子对接

4．1．3 突变体获得

4．1．4 荧光竞争结合试验

4．2 结果与分析

4．2．1 AlucOBP22同源建模与模型评分

4．2．2 分子对接结果

4．2．3 突变体蛋白获得

4．2．4 荧光竞争结合试验

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介