猪繁殖与呼吸综合征病毒GSWW/15株感染性克隆的构建与NSP2缺失标记研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种重要传染病，临床上主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统疾病。目前，PRRS在全球范围内流行，2006年，我国南方地区爆发高致病性PRRS(HP-PRRS)，给养猪带来巨大的经济损失。PRRSV变异范围广，病毒感染后造成免疫功能的损害，保护性免疫应答水平低，病毒持续感染时间长，其分子机理仍然不清楚。PRRSV感染性克隆是研究病毒基因组结构与功能的重要工具，建立国内流行毒株的反向遗传学技术平台将为研究病毒的感染机理和免疫机理奠定基础。
　　根据已测定的PRRSV/GSWW/15分离株的全长基因组序列信息，采用合成生物学的方法，将全长基因组序列分为两段（7636bp和7774bp）分别插入低拷贝pBR322载体中，然后将两个半长片段相连接得到全长cDNA克隆。将质粒线化后，体外转录获得全长RNA，经电穿孔转染BHK-21细胞拯救获得了初代病毒。初代病毒接种Marc-145细胞进行传代，接毒后36 h即可观察到完全的致病变效应(CPE)。通过RT-PCR、间接免疫荧光、测序验证，证明成功获得了PRRSV/GSWW/15株的感染性克隆。通过实时荧光定量法检测拯救病毒复制能力与原田间分离毒没有显著差异，拯救病毒感染后48 h达复制的最高水平，最高滴度达1×1010 copies/mL。本研究表明，采用长片段基因合成的方法进行PRRSV感染性克隆的构建，方法可行且速度快，为PRRSV流行毒感染致病机理、免疫机制和基于反向遗传学的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。
　　由于多个弱毒疫苗毒株的大量应用，导致疫苗毒与流行毒的重组事件频繁发生，新的变异毒株不断出现，成为当前我国PRRS防控中存在的主要问题。研制能区分疫苗免疫和自然野毒感染的标记疫苗已成为当前PRRS防控的重要技术需求。研究表明，NSP2是PRRSV变异程度最大的非结构蛋白，中间高变区存在不连续的缺失，而且存在多个具有免疫优势的B细胞表位，是研制表位缺失标记疫苗的候选区域，因此，本研究在PRRSV/GSWW/15株感染性克隆的基础上，采用融合PCR方法构建一系列NSP2中间高变区的缺失突变体，探究不同区域缺失对病毒复制的影响。结果显示，NSP2298-592、726-819、421-565、300-467、324-467、734-797位氨基酸缺失不能拯救到病毒，519-565位氨基酸缺失病毒复制能力显著下降，NSP2421-467位氨基酸缺失(GS-D4)可拯救到病毒，且传代至第8代后，病毒RNA拷贝数明显高于亲本病毒，表现出适应细胞培养的生长特性。
　　综上所述，本研究建立了PRRSV/GSWW/15株的感染性克隆，对NSP2蛋白进行系列缺失，初步明确NSP2缺失421-467位氨基酸，对病毒的复制没有影响，缺失病毒表现出很好的复制性能，为PRRSV表位缺失标记疫苗的研制奠定了良好的基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1 概述

1．2 PRRS病原及分子生物学特征

1．3 PRRSV感染与免疫机制

1．4 PRRSV感染性克隆构建策略

1．5 PRRSV反向遗传学的应用

1．6 PRRSV防治

1．7 研究目的及意义

第二章 通过全基因组序列合成构建美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆

2．1 材料和方法

2．1．1 病毒株、细胞和抗体

2．1．2 试剂及仪器

2．1．3 基因合成

2．1．4 全长cDNA拼接

2．1．5 全长质粒线性化

2．1．6 DNA体外转录

2．1．7 病毒拯救与传代

2．1．8 拯救病毒的鉴定

2．1．9 亲本病毒与拯救病毒复制能力比较

2．2 结果

2．2．1 PRRSV／GSWW／15株基因组全长cDNA质粒的鉴定

2．2．2 病毒拯救与传代

2．2．3 拯救病毒的鉴定

2．2．4 亲本病毒与拯救病毒生长曲线比较

2．3 讨论

第三章 PRRSV／GSWW／15株NSP2缺失标记研究

3．1 材料与方法

3．1．1 病毒株、细胞和抗体

3．1．2 试剂及仪器

3．1．3 NSP2缺失区域及引物设计

3．1．4 NSP2缺失质粒的构建

3．1．5 NSP2缺失质粒的线性化及体外转录

3．1．6 NSP2缺失病毒拯救与传代

3．1．7 拯救病毒的鉴定

3．1．8 亲本病毒与拯救病毒复制能力比较

3．2 结果

3．2．1 融合PCR扩增结果

3．2．2 重组质粒鉴定

3．2．3 缺失病毒拯救与传代

3．2．4 拯救缺失病毒的鉴定

3．2．5 亲本病毒与缺失病毒生长曲线比较

3．3 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介