妊娠相关糖蛋白在奶牛早期妊娠诊断上的应用研究

摘要

妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins，PAGs)是母牛胎儿滋养层细胞合成和分泌的一类糖蛋白，在母牛的妊娠过程中起着重要作用。通过检测体液中的PAGs浓度，能够快速有效地对奶牛进行早期妊娠诊断，尽早地检出空怀牛，提高牧场的繁殖效率和经济效益。因此，本试验对PAGs检测试剂盒的应用效果、奶牛PAGs的分离鉴定以及PAG4基因的原核表达和多克隆抗体的制备进行研究，以期为PAGs相关检测产品的研发提供技术支持。研究结果如下:
　　试验一:PAGs检测试剂盒在奶牛早期妊娠诊断上的应用
　　试验采集49头人工授精(Artificial Insemination，AI)后28～32 d奶牛血液样品，分离血清并应用PAGs检测试剂盒进行检测;采血当天利用兽用B超仪进行妊娠检查，并于AI后35 d用B超复检。结果表明:PAGs检测试剂盒检测奶牛早期妊娠的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确性分别为92.0％、95.8％、95.8％、92.0％、93.9％，与B超检测方法结果的一致性（Kappa值）为0.632。
　　试验二:奶牛PAGs的分离鉴定
　　从屠宰场收集4份奶牛胎儿胎盘，分别采用饱和硫酸铵沉淀、阴离子层析、SDS-PAGE凝胶电泳和液相色谱-质谱（liquid chromatograph-mass spectrometric，LC-MS）四种方法进行分离鉴定。结果显示:纯化的目的蛋白相对分子质量在55 kD左右;LC-MS成功分离鉴定出PAG1、PAG2、PAG6、PAG7、PAG9、PAG12、PAG13、PAG22共8种天然蛋白。
　　试验三:奶牛PAG4基因的原核表达及多克隆抗体的制备
　　将体外扩增的PAG4目的片段克隆至pET28a原核表达载体后，转化大肠杆菌DH5a，对菌液PCR鉴定的阳性克隆进行测序。提取测序正确菌液的质粒，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达PAG4重组多肽。将纯化后的PAG4重组多肽免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，分别采用间接ELISA法和western blot法检测抗体效价与抗体特异性。结果表明:试验成功构建了PAG4多肽的原核表达载体，并获得纯化的PAG4重组多肽;制备的多克隆抗体效价高达1∶24，000，与重组多肽蛋白、天然组织蛋白均有特异性反应，并可在一定程度上区分妊娠奶牛和未妊娠奶牛血清。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 奶牛早期妊娠检测方法的研究现状

1．1．2 直肠检测法

1．1．3 超声波检测法

1．1．4 孕酮检测法

1．1．5 早孕因子检测法

1．1．6 核酸检测法

1．2 PAGs的研究进展

1．2．1 PAGs的发现

1．2．2 PAGs基因的研究

1．2．3 FAGs结构的研究

1．2．4 PAGs的分泌模式

1．2．5 PAGs的功能

1．2．6 影响母牛PAGs浓度的因素

1．2．7 PAGs的检测方法及其在实际生产中的应用

1．3 本研究的目的和意义

第二章 妊娠相关糖蛋白检测试剂盒在奶牛早期妊娠诊断上的应用

2．1 试验材料与方法

2．1．1 试验动物

2．1．2 试验药品与仪器

2．1．3 试验方法

2．2 试验结果与分析

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 奶牛妊娠相关糖蛋白的分离鉴定

3．1 试验材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 溶液的配制

3．1．3 试验方法

3．2 试验结果与分析

3．2．1 阴离子交换层析及SDS-PAGE检测结果

3．2．2 PAGs检测试剂盒检测结果

3．2．3 聚乙二醇浓缩后目的蛋白SDS-PAGE检测结果

3．2．4 质谱鉴定结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 奶牛PAG4基因的原核表达及多克隆抗体的制备

4．1 试验材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 溶液的配制

4．1．3 试验方法

4．2 试验结果与分析

4．2．1 目的基因的获取

4．2．2 表达载体的构建与PCR鉴定

4．2．3 测序结果

4．2．4 蛋白表达结果

4．2．5 蛋白纯化结果

4．2．6 多克隆抗体效价的检测

4．2．7 Western blot检测多克隆抗体特异性

4．3 讨论

4．3．1 PAG4基因的原核表达

4．3．2 PAG4多克隆抗体的制备与检测

4．4 小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历