角蛋白降解菌地衣芽孢杆菌CP-16脂类水解酶的研究

摘要

家禽羽毛富含角蛋白是一种丰富的蛋白质资源，因其组成与结构的特殊性难于被动物消化利用。羽毛表层覆盖致密的疏水脂质层，形成羽毛与外界环境物质接触的屏障。内层为富含大量二硫键、氢键、疏水基团，结构稳定、不易降解的角蛋白。破坏羽毛表层脂质，增加蛋白酶与角蛋白结合，可加快羽毛降解速度。本论文通过对羽毛高效降解菌株地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）CP-16脂类水解酶对羽毛表层脂质水解的研究，探究脂类水解酶与角蛋白酶协同关系及其在微生物降解角蛋白中的作用。
　　B.licheniformis CP-16脂类水解酶基因在大肠杆菌中表达。在Uniprot中搜集B.licheniformis中脂类水解酶的3个酶蛋白核酸序列，根据序列设计引物，以B.licheniformis CP-16基因组DNA为模板，扩增脂类水解酶基因L-4，L-6，L-7，大小分别为747bp，783 bp，897bp。成功构建载体pET-22b-L-4、pET-22b-L-6、pET-22b-L-7。在大肠杆菌中表达、纯化，获得3种重组酶蛋白。
　　重组酶L-4、L-6、L-7酶学性质研究。重组酶L-4的最适pH为6.5，最适温度为50℃，在pH6.5～9.5、温度低于55℃的范围内酶活稳定，Fe2+、Na+、Mn2+、Ca2+(10 mmol/L)对其活性有促进作用。该酶在甲醇和二甲基亚砜(DMSO)中保存，活性可保留85％、97％，但其它有机溶剂的抑制作用明显。重组酶L-6的最适pH为7.5，最适温度为45℃，pH稳定性和温度稳定性相对较差，Zn2+、Cu2+、Fe3+(10 mmol/L)对酶活性有明显的抑制作用，其他金属离子对酶活性无影响。该酶在甲醇和DMSO中活性可保留69％、61％。重组酶L-7的最适pH为6.0，最适温度为50℃，pH稳定性和温度稳定性均与L-4基本一致，Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+(10 mmol/L)对酶活性具有促进作用，在DMSO中活性无损失。
　　脂类水解酶基因L-4、L-7在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其应用。对两种酶学性质较好的脂类水解酶基因进行优化，构建了野生型(pPICZαA-PL-4、pPICZαA-PL-7)和优化型(pPICZαA-PL-4-opt、pPICZαA-PL-7-opt)4种质粒，经限制性内切酶SacⅠ线性化后电转化入毕赤酵母X-33。优化后二者酶活分别提高了38.09％,12.16％。对优化后重组酶PL-4-opt，PL-7-opt制备冻干粉，酯酶酶活分别为1.42 U/g、37.85 U/g，脂肪酶酶活分别为85.26U/g、213.16U/g。重组酶PL-4-opt，PL-7-opt预处理天然羽毛底物，促进角蛋白酶K对底物的水解作用，促进率分别为4.32％、19.30％。脂类水解酶降解羽毛表层脂质，提高角蛋白酶水解羽毛角蛋白的效率。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 角蛋白

1．1．1 角蛋白的结构

1．1．2 羽毛的结构成分

1．1．3 角蛋白的处理方式

1．1．4 角蛋白资源的应用

1．2 应用于羽毛降解的酶类

1．2．1 角蛋白酶

1．2．2 二硫键还原酶

1．2．3 脂类水解酶

1．3 基因异源表达系统

1．3．1 原核表达系统

1．3．2 真核表达系统

1．4 研究的目的意义

1．5 技术路线

第二章 CP-16菌脂类水解酶基因在大肠杆菌中的表达

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株和载体

2．1．2 工具酶和试剂

2．1．3 培养基和主要化学试剂的配制

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 脂类水解酶基因序列的克隆

2．1．6 脂类水解酶表达载体的构建

2．1．7 大肠杆菌工程菌的构建

2．1．8 工程菌的诱导表达

2．1．9 包涵体复性和酶活测定

2．2 结果与分析

2．2．1 地衣芽孢杆菌总DNA的提取

2．2．2 脂类水解酶基因的克隆

2．2．3 脂类水解酶基因的测序结果

2．2．4 表达载体的构建

2．2．5 重组菌株的表达

2．2．6 包涵体蛋白的纯化复性

2．2．7 酶蛋白复性后酶活

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 不同具脂类水解酶活性的重组酶酶学性质研究

3．1 材料与方法

3．1．1 酶与底物

3．1．2 试剂与溶液

3．1．3 主要仪器设备

3．1．5 各重组脂类水解酶最适温度和温度稳定性

3．1．6 金属离子对各重组脂类水解酶活性的影响

3．1．7 有机溶剂对各重组脂类水解酶活性的影响

3．2 结果与分析

3．2．1 最适pH

3．2．2 pH稳定性

3．2．3 最适温度

3．2．4 温度稳定性

3．2．5 金属离子对重组酶酶活性的影响

3．2．6 有机溶剂对重组酶酶活性的影响

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 CP-16菌脂类水解酶在毕赤酵母中的表达及其应用

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株和载体

4．1．2 工具酶和试剂

4．1．3 培养基和主要化学试剂的配制

4．1．4 主要仪器设备

4．1．5 真核表达脂类水解酶基因的克隆

4．1．6 真核脂类水解酶表达载体的构建

4．1．7 脂类水解酶基因序列的优化和表达质粒pPICZαA-PL-opt的构建

4．1．8 毕赤酵母工程菌株的构建

4．1．9 重组菌株摇瓶发酵

4．1．10 脂类水解酶酶活测定

4．1．11 对重组酶PL制备冻干粉

4．1．12 重组酶对角蛋白酶水解羽毛的影响

4．2 结果与分析

4．2．1 真核表达脂类水解酶基因的克隆

4．2．2 表达载体pPICZαA-PL的构建

4．2．3 脂类水解酶基因序列的优化

4．2．4 优化后的表达载体pPICZαA-PL-opt的构建

4．2．5 重组表达质粒的线性化及电转化

4．2．6 重组菌株的摇瓶发酵及酶活测定

4．2．7 重组酶的冻干粉酶活测定

4．2．8 两种重组酶对角蛋白降解的作用

4．3 讨论

4．4 小结

5．1 主要结论

5．2 创新点

5．3 研究展望

参考文献

致谢

作者简历