蒺藜苜蓿WOX家族基因HEADLESS的生物学功能解析

摘要

植物的正常生长离不开茎尖分生组织和花分生组织的正常发育。拟南芥中研究结果表明，WUSCHEL(WUS)基因主要参与茎尖干细胞的维持，在胚珠和花粉发育过程中也起着重要的作用。WUS可以通过诱导细胞分裂素响应调节因子来调控分生组织的发育，还可以和CLAVATA（CLV)形成负反馈调节环来决定干细胞分裂与分化之间的动态平衡，同时WUS可以与AGAMOUS(AG)基因协同调控花分生组织向花器官的转化。但是在豆科作物中该基因如何调控并影响干细胞的维持和发育目前还没有明确的研究结果。
　　蒺藜苜蓿是研究豆科功能基因组学的模式生物，其基因组较小，且遗传转化体系较为成熟。以本实验室前期得到的三个茎尖分生组织发育异常的突变体headless(hdl)为基础，成功克隆到了HDL基因，通过对hdl-1突变体的表型分析和对HDL基因功能进行解析，初步明确了HDL基因在蒺藜苜蓿茎尖分生组织发育和叶型发育中的调控作用。主要研究结果如下:
　　通过正向遗传学的方法，我们在豆科模式植物蒺藜苜蓿中克隆了一个拟南芥WUS的同源基因HDL，该基因主要参与蒺藜苜蓿茎尖分生组织维持和叶片发育。当HDL突变后，茎尖分生组织发育异常，主要表现在茎尖分生组织形态和功能不完整以及腋芽分生组织的不规则发育，导致hdl突变体丧失顶端优势，只进行营养生长，没有明显的茎秆出现。hdl-1突变体叶片由于尖端伸长减少而导致其叶片长度变短，这导致突变体叶片呈现心形的表型，这是拟南芥wus突变体中没有描述的新表型。对HDL蛋白进行转录活性分析得出，HDL可以与TOPLESS(TPL)相互作用形成共抑制子，且二者的互作需要HDL蛋白保守的WUS-box和EAR-like结构域。进一步遗传学分析发现，尽管HDL和蒺藜苜蓿叶片生长的关键调节因子STENOFOLIA(STF)都可以招募TPL蛋白，但是在调控蒺藜苜蓿叶片发育中，二者功能是相对独立的。我们的研究结果表明，和拟南芥相比，WUS/HDL在调控蒺藜苜蓿分生组织和叶片发育中的功能既有保守又存在分化，为理解豆科植物分生组织发育和叶型发育提供了新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 WOX家族成员研究进展

1．1．3 WOX基因生物学功能

1．2 WUS及其同源基因研究进展

1．2．1 拟南芥中WUS研究进展

1．2．2 其他物种中WUS同源基因研究进展

第二章 论文选题依据和研究方法

2．1 论文选题依据

2．2 研究方法

3．1 实验材料和试剂

3．2．2 目的片段的扩增，回收以及连接

3．2．3 Gateway系统载体的构建

3．2．4 大肠杆菌以及农杆菌介导的载体转化

3．2．5 质粒DNA的提取以及酶切鉴定

3．2．6 Trizol法提取蒺藜苜蓿总RNA

3．2．9 石蜡切片制作方法

3．2．10 扫描电镜常规样品制备技术

3．2．11 原位杂交实验

3．2．12 农杆菌介导的烟草瞬时转化

3．2．13 PEG介导的拟南芥原生质体转化

3．2．14 农杆菌介导的蒺藜苜蓿的遗传转化

第四章 实验结果与分析

4．1．3 hdl-1突变体侧芽发育异常

4．1．4 hdl-1突变体叶型发育异常

4．1．5 hdl-1突变体侧生分生组织和叶原基发育异常

4．2 HDL基因克隆

4．2．1 HDL基因结构以及RT-PCR检测

4．2．2 等位验证实验

4．2．3 转基因互补实验

4．2．4 HDL蛋白系统进化分析

4．2．5 HDL蛋白氨基酸序列比对

4．2．6 原位杂交实验检测HDL的表达区域

4．3 HDL蛋白转录活性分析

4．3．1 HDL定位在细胞核中

4．3．2 HDL自身可以形成同源二聚体

4．3．3 HDL具有转录抑制活性

4．4 HDL参与调控细胞分裂素响应调节因子

4．4．2 HDL蛋白参与调控ARRs基因的表达

4．5 HDL基因在叶型发育中的作用

4．5．1 hdl-1 stf双突变体表型分析

4．5．2 qPCR检测叶型调控基因AS2的表达量

5．1 全文结论

5．2 讨论

参考文献

附录

致谢

作者简历