邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯降解菌的分离及降解机理研究

摘要

酞酸酯（Phthalate acid esters，PAEs）是一类典型的难降解有机污染物，具有内分泌干扰特性。本文从选育高效降解邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（Di-(2-ethylehxyl)phthalate，DEHP)的微生物入手，从近海岸潮间带塑料制品污染的底泥中筛选出一株DEHP高效降解菌YC-YT1，对其降解DEHP的生物降解特性进行了研究;通过全基因组测序获得了菌株YC-YT1完整的遗传信息，利用比较基因组学和生物信息学预测并获取了降解相关的基因;借助传统分子生物学技术结合物质代谢途径分析，对相关降解酶进行功能验证。本论文研究成果如下:
　　(1)从近海岸潮间带塑料制品污染的底泥中筛选出一株DEHP高效降解菌YC-YT1，经鉴定为赤红球菌（Rhodococcus ruber）。该菌株能在72小时内完全降解100mg/L DEHP，并且可高效降解13种不同类型的酞酸酯化合物和多种芳香族化合物;此外，YC-YT1能有效降解低浓度的DEHP，是现今已报道的DEHP降解菌中底物谱最宽、低浓度DEHP利用率最高的赤红球菌，为环境修复酞酸酯污染物储备了降解菌资源，
　　(2)菌株YC-YT1在不同环境条件下降解DEHP能力的单因素研究，结果表明YC-YT1对温度、pH和盐离子浓度都拥有较高的耐受度，菌株的接种量对降解能力无明显影响，添加一定量的葡萄糖可明显提升菌株的降解能力，采用响应面法对有显著影响的单因素进行了组合优化，菌株最优降解条件为额外添加50g/L葡萄糖，pH75，温度33℃;
　　(3)液相/质谱分析检测了菌株YC-YT1降解DEHP过程中的中间产物，DEHP首先降解生成邻苯二甲酸单（2-乙基己）酯（MEHP），继而生成邻苯二甲酸再进一步进入三羧酸循环。此外，菌株YC-YT1通过调整其细胞表面疏水性(Cell surface hydrophobicity,CSH)获取了良好的环境适应能力，可修复797％-959％的污染土壤和水体，在生物修复被DEHP污染的盐碱性环境上具有巨大的应用潜能。
　　(4)利用PacBio三代测序平台对菌株YC-YT1进行了全基因组测序，序列提交至GenBank(CP023712)。菌株YC-YT1包括一个环状基因组（566Mb，GC含量7041％）和两个质粒（plasmid01，159Kb，GC含量672％,plasmid02，77Kb，GC含量6492％），共预测到5525个CDS，其中5375个CDS被注释到公共数据库(97％)，通过同源比对结合比较基因组学分析，挖掘参与DEHP降解的基因和基因簇，详细分析了酞酸酯双加氧酶基因和苯环双加氧酶基因，涉及联苯、邻苯二酚、原儿茶酸、苯甲酸和邻苯二甲酸等物质的降解;获得了两个参与DEHP降解的新型酯酶基因Dehp1199和Mehp4077，并对Dehp1199基因进行了功能验证和酶学特征分析，发现Dehp1199酯酶比现今已报道的DEHP降解酶有较宽的pH和温度适应范围、更好的稳定耐受力，为DEHP降解酶的开发，改造提供了重要资源。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 酞酸酯化合物概述

1．1．1 酞酸酯化合物的来源及性质

1．1．2 酞酸酯化合物的危害及管控

1．1．3 典型酞酸酯DEHP概述

1．2 近海水域和印染废水的特点和危害

1．2．2 印染废水污染的特点和现状

1．3 酞酸酯化合物的微生物降解研究进展

1．4 微生物基因组学研究

1．4．2 微生物比较基因组学

1．5 研究目的与意义

第二章 DEHP降解菌的分离与鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 样品采集

2．1．2 主要试剂、菌株及质粒

2．1．4 培养基

2．1．5 溶液配制

2．2 实验方法

2．2．3 降解菌株的鉴定

2．2．4 数据的统计与分析

2．3 结果与分析

2．3．1 检测方法与标准曲线的建立

2．3．2 降解菌的分离与筛选

2．3．3 降解菌YC-YT1生长曲线绘制及生物量测定

2．3．4 降解菌的鉴定

2．3．5 菌株YC-YT1的BIOLOG鉴定

2．3．6 菌株YC-YT1的16S rDNA结果

2．4 讨论

第三章 菌株YC-YT1的降解特性与代谢途径分析

3．1 实验材料

3．1．2 培养基与溶液配制

3．2．3 菌株YC-YT1的底物广谱性分析

3．2．4 菌株YC-YT1在DEHP最大浓度和最小浓度下的降解分析

3．2．7 菌株YC-YT1的应用潜能探索

3．3 结果与分析

3．3．1 不同环境因素对降解的影响

3．3．2 菌株YC-YT1降解DEHP的条件优化

3．3．3 菌株YC-YT1的底物谱分析

3．3．4 菌株YC-YT1在DEHP最大浓度和最小浓度下的降解分析

3．3．5 菌株YC-YT1降解DEHP的酶促反应动力学分析

3．3．6 菌株YC-YT1对DEHP的代谢中间产物检测与代谢途径分析

3．3．7 菌株YC-YT1的应用潜能探索

3．4 讨论

第四章 菌株YC-YT1基因组测序及分析

4．1 实验材料

4．2．3 生物信息分析流程

4．3 结果与分析

4．3．2 质控、组装及基因预测

4．3．3 基因功能注释

4．3．4 重复序列预测

4．3．5 基因岛预测

4．3．6 前噬菌体分析

4．3．8 基因功能注释

4．3．9 菌株YC-YT1平均核苷酸相似性分析

4．3．10 菌株YC-YT1基因组注释中降解相关特性分析

4．4 讨论

第五章 菌株YC-YT1的比较基因组学分析

5．1 实验材料

5．3．1 基于RAST平台的比较基因组学分析

5．3．2 PAEs降解基因簇

5．3．3 酞酸酯降解酯酶基因预测及筛选

5．4 讨论

第六章 DEHP降解酯酶基因的克隆表达及酶学性质分析

6．1 材料与方法

6．1．3 药品与试剂

6．2 实验方法

6．2．3 Dehp1199和Mehp4077水解酯酶功能验证

6．2．5 Dehp1199和Mehp4077的生物信息学初步分析

6．3．2 构建得到pET-Dehp1199和pET-Mehp4077

6．3．3 蛋白表达纯化

6．3．4 Dehp1199和Mehp4077的功能验证

6．3．5 Dehp1199的酶学特征分析

6．3．6 Dehp1199和Mehp4077的生物信息学初步分析

6．3．7 酶蛋白Dehp1199和Mehp4077的同源建模及与相应底物的分子对接分析

6．4 讨论

第七章 全文总结

7．1 实验结果

7．2 创新点

7．3 研究展望

参考文献

附录

致谢

作者简历