一个新的棉花矮化突变体基因的精细定位及功能初步验证

摘要

植物矮化是重要的农艺性状。矮化品种具有抗倒伏能力强、适宜密植及机械化管理等特点，对于减少劳动强度、提高肥料利用率和提高产量具有重要意义，矮化突变体在矮化育种中具有重要的利用价值，同时也是研究植物茎的生长及激素调控的重要基因资源。棉花具有无限生长习性，植株高大。当前，世界上大多数产棉国，广泛采用化学抑制剂缩节胺控制棉花生长，使株高普遍控制在90-100cm左右。尤其是自我国新疆“密、矮、早”种植技术的成功以来，使用化控棉花株高已经成为新疆棉花增产的重要措施。但大量喷施化学抑制剂缩节胺费工费事，还带来严重的环境污染问题。棉花是重要的经济作物之一，在世界及我国国民经济中占重要地位，因此，充分利用自然矮源，选育矮杆品种仍然是提高产量、提高农业生产效率的重要措施。
　　本课题1998年在一个陆地棉廊坊1号与野生棉黄褐棉杂交选育12世代的材料LHF10中，发现一个自然矮化突变体，1998-2005年通过自交纯化，暂命名“AS98”。本研究建立在前人初定位研究的基础之上，利用QTL-seq对初定位进行验证，测序结果在D12染色体54Mb-55Mb出现显著高于阂值的△SNP-mdex值，该区间包含一个SSR标记NAU5204，这与前人构建的遗传连锁图上的一个标记吻合，证明了测序结果的可靠性，即D12.54Mb-55Mb可以作为控制AS98矮化基因的候选区间;
　　随后我们对候选区间进行SV(Structure Variation)检测，发现在给定的候选区间内矮株（突变体）和高株（野生型）存在一个14K大片段的拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)，为了验证该CNV的存在，我们设计扩增该段的Overlap引物，最终利用两个端点引物的组合(14k-5F/14k-2R)通过PCR成功的在矮株中扩出目的片段而高株中未能扩出，为了进一步验证结果的可靠性，我们利用该引物在10个矮株及10个高株中以基因组DNA为模板扩增，结果正如我们的预期，10个矮株中全部扩出，而高株中均未能扩出，证明CNV与矮化性状连锁。
　　进一步研究发现该CNV内包含一个基因EXTR-DWARF，我们从CottonFGD网站上获得该基因的序列并利用NCBI网站的Prmer Desigin功能设计该基因的全长引物，分别以矮株、半矮株、高株的基因组DNA为模板克隆该基因，测序结果显示该基因在三种表型不一的植株中序列完全相同，随后矮株和高株中qRT-PCR结果显示该基因在突变体及野生型的表达量存在极显著差异;
　　为了进一步确定该基因就是控制AS98植株矮化的候选基因，经VIGS(Virus Induced Gene Silencing，病毒诱导的基因沉默)试验接种沉默该基因的病毒的矮化植株能够恢复株高至野生型高度，这也证明了该基因有很大的可能是与AS98植株矮化相关基因。
　　本研究所用材料表现为极端矮化，是研究植物矮化机理的资源材料，本实验通过QTL-seq方法获得矮化相关位点信号区域，并利用二代测序获得的mapping reads鉴定到该区域内一个与矮化性状高度连锁的CNV标记，该标记中所携带的EXTR-DWARF基因经VIGS验证其功能与植株矮化相关。本研究首次结合QTL-seq和reads分析方法鉴定到与陆地棉极端矮化性状连锁的功能基因，为未来QTL精细定位和功能基因图位克隆提供了新的思路。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 植物矮化

1．1．1 植物矮化与赤霉素(GA)

1．1．2 植物矮化与油菜素内脂(BR)

1．2 棉花矮化资源及其国内外研究进展

1．3 一个新的矮化突变体的发现

1．4 分子标记与基因定位

1．4．1 分子标记的类型

1．4．2 QTL-seq，基因定位的新方法

1．5 本研究的目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．2．2 配制提取棉花基因组DNA的溶液

2．2．3 提取棉花基因组DNA

2．2．4 利用BSA(Bulked Segregant Analysis)对初定位区间进行验证

2．2．5 棉花组织总RNA的提取

2．2．6 cDNA的合成

2．2．7 候选基因的qRT-PCR分析

2．2．8 InDel标记的开发及群体基因分型

2．2．9 遗传连锁图谱的构建及基因定位

2．2．10 候选区段Bam文件重分析及新的候选基因的发现

2．2．11 候选基因表达量的分析

2．2．12 候选基因克隆

2．2．13 VIGS对候选基因功能进行验证

第三章 结果分析

3．1 性状调查

3．2 BSA(Bulked Segregant Analysis)基因定位

3．3 候选基因的差异表达量分析

3．4 SSR和InDel标记对候选区间加密实现精细定位

3．5 候选区段串联重复的发现及验证

3．6 新的候选基因的发现及定量分析结果

3．7 VIGS验证结果

第四章 讨论

4．1 矮化突变体AS98遗传分析

4．2 AS98基因的定位分析

4．2．1 测序结果与初定位

4．2．2 精细定位

4．3 AS98基因组拷贝数变异(Copy number variations， CNVs)与其表型的关系

4．4 本研究的应用

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历