番茄、马铃薯及西瓜病毒病的病原鉴定

摘要

近年来，番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)在多地发生严重危害。采用小RNA深度测序和RT-PCR相结合的方法对采自黑龙江省的番茄病毒病样品中病毒进行了鉴定。提取番茄样品的RNA并构建小RNA文库进行测序，数据分析发现比对至TSWV基因组的reads数占比对到病毒核酸总reads数的92.64％，表明侵染此番茄样品的病原物可能是TSWV。利用RT-PCR方法进一步确定侵染此番茄样品的病毒为TSWV，将其命名为TSWV-HLJ1。对TSWV-HLJ1的全序列进行分析并构建系统进化树，结果表明TSWV-HLJ1与TSWV云南甜椒分离物YNgp的亲缘关系最近。介体传毒试验表明，西花蓟马可将TSWV-HLJ1传播感染健康寄主植物，且健康蓟马对带毒辣椒的选择性更强。汁液摩擦试验表明，TSWV黑龙江分离物能够侵染本氏烟、辣椒和番茄。这是我国首次在黑龙江省报道TSWV。
　　2016年，我们在海南发现了呈严重斑驳、皱缩症状的番茄植株，利用Dot-ELISA和RT-PCR技术相结合的方法对病原进行鉴定。Dot-ELISA结果显示，感病番茄样品的汁液与烟草花叶病毒(TMV)的单克隆抗体呈明显的阳性反应。RT-PCR和序列分析结果进一步表明侵染此番茄样品的病原物为番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus，ToMMV)。我们扩增并分析了感病番茄样品中ToMMV的全序列，发现此分离物与ToMMV YYMLJ和ToMMV TiLhaLJ分离物亲缘关系最近，将其命名为ToMMV海南分离物(ToMMV HN)。汁液摩擦接种实验表明ToMMVHainan可以侵染本氏烟，辣椒和番茄并引起严重的症状。这是我国首次在海南省发现ToMMV对番茄造成危害。
　　2017年，为调查我国马铃薯主产区马铃薯病毒病的发生情况，我们从内蒙古、吉林、青海、新疆四省采集了53份马铃薯样品。利用RT-PCR方法对PVSa、PVSb、PVX、PVM、PVY、PLRV、PVA、PMTV、PBRSV、PYDV10种侵染马铃薯的病毒进行筛查。检测结果表明，53份马铃薯样品中有45份样品带毒，检测出的病毒主要是PVY和PLRV，39％的样品由PVY单独侵染，6％的样品由PLRV单独侵染。另外，有20份样品由两种病毒复合侵染，34％的样品由PVY和PLRV复合侵染，4％的样品由PVY和PVSa复合侵染。
　　2017年，我们从海南省采集到呈花叶、皱缩症状的西瓜样品，采用小RNA深度测序和RT-PCR相结合的方法对样品中的病毒进行了鉴定。检测结果表明感病西瓜样品包含甜瓜黄斑病(Melon yellow spot virus，MYSV)和西瓜银斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus，WSMoV)两种病毒。我们获得了以上两种病毒的全长核苷酸序列并构建系统进化树，结果表明MYSV海南西瓜分离物的RNA L、M、S分别与MYSV日本甜瓜(AB061774)、泰国黄瓜(KX711614)和三亚甜瓜(GQ397254)分离物的核苷酸相似度最高;WSMoV海南西瓜分离物的RNA L和RNA M均与WSMoV广东西瓜分离物GZ的RNA L(JX177647)和RNA M(JX177646)核苷酸相似度最高;WSMoV分离物的RNA S与日本西瓜分离物WS-Y的RNA S(AB042650)核苷酸相似度最高。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 植物病毒病研究概况

1．2 植物病毒检测方法研究进展

1．2．1 生物学鉴定法

1．2．2 电子显微镜观察法

1．2．3 血清学检测法

1．2．4 分子生物学方法

1．2．5 小RNA深度测序技术

1．3 番茄病毒病的发生及危害

1．3．1 番茄斑萎病毒

1．3．2 烟草花叶病毒

1．3．3 黄瓜花叶病毒

1．3．4 番茄斑驳花叶病毒

1．4 马铃薯病毒病的发生及危害

1．4．1 马铃薯Y病毒

1．4．2 马铃薯卷叶病毒

1．4．3 马铃薯A病毒

1．4．4 马铃薯X病毒

1．4．5 马铃薯M病毒

1．5．2 西瓜银斑驳病毒

1．5．3 甜瓜黄斑病毒

1．6 研究目的和意义

第二章 黑龙江省番茄斑萎病毒的鉴定及其部分特征分析

2．1 材料

2．1．3 菌株与抗体

2．1．4 试验仪器

2．2 方法

2．2．1 植物总RNA的小量提取

2．2．3 小RNA深度测序及生物信息分析

2．2．5 DNA片段的纯化

2．2．6 载体连接和转化

2．2．7 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．8 菌落PCR

2．2．9 碱裂解法提取质粒

2．2．10 DNA测序，序列组装和分析

2．2．11 介体传毒

2．2．12 植物培育和汁液摩擦接种

2．3 结果

2．3．1 番茄样品小RNA高通量测序结果及数据分析

2．3．2 番茄样品全基因组序列的扩增及序列相似性分析

2．3．3 番茄样品全基因组序列的系统进化树分析

2．3．4 西花蓟马对TSWV-HLJ1的传播

2．3．5 TSWV-HLJ1的生物学接种试验

2．3．6 健康的西花蓟马对带毒和健康辣椒植株的选择性

2．3．7 感毒西花蓟马对带毒和健康辣椒植株的选择性

2．4 讨论

第三章 海南省番茄斑驳花叶病毒的检测和分析

3．1 材料

3．1．1 样品采集

3．1．2 试剂与溶液

3．2．1 Dot-ELISA

3．2．2 植物总RNA的小量提取

3．2．3 序列扩增和测序

3．3．1 利用Dot-ELISA和RT-PCR对病毒的检测

3．3．2 全序列扩增和分析

3．3．3 生物学特征分析

3．4 讨论

第四章 我国部分马铃薯产区病毒病发生情况调查与分析

4．1 材料

4．2．3 PCR扩增

4．3 结果

4．3．1 内蒙古马铃薯样品病毒检测结果

4．3．2 青海和新疆马铃薯样品病毒检测结果

4．3．3 吉林马铃薯样品病毒检测结果

4．4 讨论

第五章 海南省西瓜病毒病的鉴定

5．1 材料

5．1．1 样品采集

5．1．2 溶液与试剂

5．1．3 试验仪器

5．2 方法

5．3 结果

5．3．1 西瓜样品小RNA高通量测序结果及数据分析

5．3．2 西瓜样品全基因组序列的扩增及序列相似性分析

5．3．3 西瓜样品全基因组序列的系统进化树分析

5．4 讨论

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历