西瓜噬酸菌效应蛋白Ace1功能研究及光照黑暗条件下致病性差异分析

摘要

西瓜噬酸菌是革兰氏阴性细菌，主要为害西瓜和甜瓜，造成严重的经济损失，其致病机理目前尚不清楚。植物病原细菌T3SS分泌的Ⅲ型效应蛋白(T3Es)可以抑制植物免疫反应，其为致病过程中的关键因子。过去的报道证实T3SS是西瓜噬酸菌致病过程中的决定性因素，但西瓜噬酸菌中T3Es的研究却鲜有报道。为此，本研究展开了西瓜噬酸茵T3Es鉴定以及功能分析的研究。
　　(1)西瓜噬酸菌中T3SS潜在调控基因hrpG以及hrpX的功能研究
　　hrpG及hrpX参与调控生物膜的形成，促进了西瓜噬酸菌激发非寄主普通烟HR的能力，增强了西瓜噬酸菌激发寄主本氏烟ROS爆发，且对致病性有重大贡献，更重要的是其参与调控T3Es的表达。
　　(2)西瓜噬酸菌中候选Ⅲ型效应蛋白的初步筛选研究
　　本研究对野生型菌株Aac5、hrpG及hrpX突变株进行了转录组测序，获得了大量差异基因。本研究还利用生物信息学方法预测了西瓜噬酸菌中潜在的T3Es，结合转录组差异基因综合分析确定了20个候选基因，并对20个基因进行了初步筛选，从中获得了4个候选基因作为接下来的研究对象。
　　(3)西瓜噬酸菌潜在Ⅲ型效应蛋白Ace1的鉴定及功能分析
　　以ace1基因作为研究对象，通过Western blot、qPCR、启动子活性测定等方法验证ace1为一个新的Ⅲ型效应蛋白。功能分析证实Ace1在西瓜噬酸菌侵染天然寄主西瓜过程中起到促进作用;Ace1抑制寄主本氏烟ROS爆发及胼胝质沉积;Ace1蛋白在寄主本氏烟中可以定位于整个细胞;Ace1抑制Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000菌株中AvrPto效应蛋白诱导的本氏烟PCD;利用免疫共沉淀及质谱分析，本研究获得了Ace1在本氏烟中潜在的互作靶标蛋白，双分子荧光技术以及qPCR技术证实其可能存在互作关系，但仍需进一步验证。
　　(4)光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌致病性差异分析
　　光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌致病因子表达及其与寄主互作过程中诱导寄主抗性反应存在显著差异，光照条件抑制西瓜噬酸菌的致病能力;在光照条件下西瓜噬酸菌中lov基因抑制运动能力，但lov缺失后对整体致病能力影响不显著;iTRAQ技术分析表明光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌差异表达蛋白77个，涉及多条致病代谢通路，且筛选到一个受到黑暗诱导表达的潜在的Ⅲ型效应蛋白。
　　综上，本研究确定了西瓜噬酸菌中hrpG及hrpX参与调控T3Es的表达;初筛获得了西瓜噬酸菌中4个潜在的T3Es，其中Ace1确定为一个Ⅲ型效应蛋白，并发现Ace1能抑制植物的免疫反应;发现光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌致病性存在差异。这些为后续西瓜噬酸菌分子致病机理的解析奠定了重要基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 瓜类细菌性果斑病研究概述

1．1．1 瓜类细菌性果斑病发生与为害

1．1．2 西瓜噬酸菌分类地位及病原生物学

1．1．3 发病症状及病害侵染循环

1．1．4 西瓜噬酸菌的遗传多样性

1．1．5 西瓜噬酸菌致病机理

1．1．6 瓜类细菌性果斑病的防治方法

1．2 植物与病原细菌互作机制研究进展

1．2．1 植物免疫系统概述

1．2．2 植物病原细菌T3SS调控T3Es的表达

1．2．3 植物病原细菌T3Es的鉴定方法

1．2．4 植物病原细菌T3Es抑制植物免疫反应

1．2．5 西瓜噬酸菌中T3Es研究进展

1．3 光与植物病原细菌致病性的关系

1．3．1 光对植物病原细菌及寄主抗性反应的影响

1．3．2 细菌中光受体蛋白研究进展

1．3．3 LOV蛋白研究进展

1．4 研究目的与意义

1．4．1 效应蛋白鉴定及功能分析

1．4．2 光调控西瓜噬酸菌致病性差异

第二章 T3SS核心基因hrpG以及hrpX的功能分析

2．1 试验材料、试剂及仪器

2．1．1 供试菌株、质粒及培养条件

2．1．2 试验中所用到的培养基及溶液

2．1．3 试验中用到的试剂及仪器

2．2 试验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 细菌基因组DNA的提取

2．2．3 载体构建

2．2．4 筛选突变体菌株

2．2．5 互补菌株的构建

2．2．6 致病性测定及过敏性坏死反应测定

2．2．7 活性氧(ROS)测定

2．2．8 生物膜测定

2．2．9 目的基因转录水平表达测定

2．2．10 启动子活性测定

2．2．11 Western blot试验

2．2．12 统计分析

2．3 结果与分析

2．3．2 西瓜噬酸菌Aac5中hrpG以及hrpX缺失突变体的构建

2．3．3 西瓜噬酸菌Aac5中hrpG以及hrpX互补菌株的构建

2．3．5 hrpG以及hrpX正调控西瓜噬酸菌诱导非寄主HR能力

2．3．6 hrpG以及hrpX负调控西瓜噬酸菌诱导寄主ROS爆发能力

2．3．7 hrpG以及hrpX正调控西瓜噬酸菌致病性

2．3．8 hrpG为hrpX上游调控因子

2．3．9 hrpG以及hrpX调控T3Es的表达

2．4 讨论

第三章 西瓜噬酸菌中候选T3Es的筛选

3．1 材料与方法

3．1．1 供试菌株、质粒及培养条件

3．1．2 试验中所用到的培养基及溶液

3．1．3 试验中用到的试剂及仪器

3．2 试验方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 转录组测定及分析过程

3．2．3 生物信息学预测分析T3Es

3．2．4 Ace1与PCD激发子共表达试验

3．2．5 定量PCR分析基因表达量变化

3．3 结果与分析

3．3．1 转录组差异基因分析

3．3．2 转录组差异基因与生物信息学关联分析预测T3Es

3．3．3 候选效应蛋白抑制Bax诱导的PCD能力

3．4 讨论

第四章 候选效应蛋白Ace1的鉴定及功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 供试菌株、质粒及培养条件

4．1．2 试验中所用到的培养基及溶液

4．1．3 试验中用到的试剂及仪器

4．2 试验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 生物信息学分析

4．2．4 西瓜噬酸菌在寄主体内生长能力测定

4．2．5 ROS测定试验

4．2．6 胼胝质沉积测定试验

4．2．7 蛋白亚细胞定位试验

4．2．8 Ace1抑制AvrPto诱导PCD能力试验

4．2．9 IP试验及质谱分析

4．3．2 Ace1为T3SS分泌的效应蛋白

4．3．3 T3SS中核心基因hrpG及hrpX调控ace1的表达

4．3．4 ace1缺失突变株以及互补菌株的构建

4．3．5 Ace1正调控西瓜噬酸菌致病能力

4．3．6 Ace1在本氏烟中定位于整个细胞

4．3．7 Ace1抑制寄主中ROS爆发

4．3．9 Ace1抑制AvrPto诱导的PCD反应

4．3．10 Ace1与ACAT1互作关系验证

4．4 讨论

第五章 光照及黑暗条件对西瓜噬酸菌致病性的差异研究

5．1 材料与方法

5．1．1 供试菌株、质粒及培养条件

5．1．2 培养基及溶液

5．1．3 试验中所用到的试剂及仪器

5．2 试验方法

5．2．1 引物设计

5．2．2 光照以及黑暗条件下运动性测定

5．2．3 光照以及黑暗条件下生物膜测定

5．2．9 致病性测定

5．3 结果与分析

5．3．1 光照抑制西瓜噬酸菌运动性

5．3．2 光照抑制西瓜噬酸菌生物膜形成

5．3．3 光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌菌落形态存在差异

5．3．5 光照促进寄主响应西瓜噬酸菌后ROS爆发

5．3．6 光照抑制西瓜噬酸菌T3SS的表达

5．3．7 光照抑制西瓜噬酸菌对本氏烟的致病能力

5．3．9 lov对西瓜噬酸菌致病能力无显著影响

5．3．10 光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌蛋白组差异分析

5．3．11 黑暗条件诱导潜在Ⅲ型效应蛋白Ace4的表达

5．4 讨论

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

作者简介