陆地棉间接防御物质萜烯同系物的合成代谢研究

摘要

棉花是世界上重要的经济作物。棉花上主要害虫绿盲蝽及棉铃虫严重影响棉花生产。研究棉花-害虫-天敌三者间的化学通讯，有助于利用化学信息物质对害虫进行绿色防控。本文围绕植物间接防御的化学信息物质萜烯同系物DMNT和TMTT，通过基因功能验证鉴定直接参与萜烯同系物生成的CYP基因;结合已报道的参与萜烯同系物合成的TPS基因，对参与萜烯同系物生成CYP与TPS的共表达进行了研究，为高表达萜烯同系物的转基因棉花研发及其在农业害虫绿色防控中的应用奠定基础。 1.室内测定了萜烯同系物DMNT和TMTT对棉花害虫天敌寄生蜂的生态学行为影响。首先，收集分析棉铃虫取食及绿盲蝽取食诱导的棉花挥发物，发现萜烯同系物DMNT和TMTT均是虫害诱导的棉花挥发物组分;然后，通过昆虫触角电位测定发现棉铃虫寄生蜂中红侧沟茧蜂和绿盲蝽寄生蜂红颈常室茧蜂均对DMNT和TMTT呈现出剂量反应，行为试验发现中红侧沟茧蜂雌虫对DMNT和TMTT均有选择偏好性，红颈常室茧蜂雌虫对TMTT也有趋向性。这说明萜烯同系物DMNT和TMTT吸引棉花害虫天敌参与棉花的间接防御。 2.分析了陆地棉中全部的P450基因家族。首先根据已公布的陆地棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉和拟南芥基因组数据及P450Homepage上公布的初命名的雷蒙德氏棉P450序列，对陆地棉中筛选的P450进行相似度比较，并根据P450命名规则对其进行初步命名。从陆地棉中共筛选到565条CYP序列，属于9个CYP集团，42个CYP家族，其中有两条序列因未比对到相似度大于40％的序列而未归类。通过系统进化分析，比较了陆地棉，雷蒙德氏棉，亚洲棉和拟南芥中P450的进化关系，陆地棉与拟南芥均属于相同的9个CYP集团，其中，CYP702、CYP705、CYP708、CYP709、CYP720和CYP721家族为拟南芥特有，CYP736和CYP749家族为棉属种特有。由于CYP71集团各成员主要响应植物胁迫，拟南芥调控萜烯同系物合成的P450基因属于CYP71集团中的CYP82家族成员，我们进一步对陆地棉CYP82家族成员和其他植物中的CYP82成员进行了聚类分析，并对陆地棉CYP82成员二级结构进行分析，为研究陆地棉CYP82家族成员功能提供参考。 3.参与萜烯同系物合成的P450基因功能验证。结合已报道的陆地棉基因组、转录组数据及已报道的拟南芥中参与萜烯同系物TMTT生成的AtCYP82G1序列，筛选陆地棉中参与萜烯同系物合成的候选基因，通过酵母真核表达及酶活测定对候选基因蛋白进行体外酶活验证，发现GhCYP82L1和GhCYP82L2均能催化橙花叔醇生成DMNT，催化香叶基芳樟醇生成TMTT，当候选基因蛋白不与细胞色素P450还原酶共表达时，橙花叔醇与香叶基芳樟醇并不能被催化;对GhCYP82L1和GhCYP82L2基因的表达谱分析发现这两个目的基因均被害虫取食诱导表达，在茎和叶中的表达量显著高于未被取食的对照组，在根中几乎不表达。通过转基因技术将GhCYP82L1和GhCYP82L2基因转化至烟草。荧光定量PCR分析表明目的基因在烟草中高表达。顶空动态收集转基因烟草及棉铃虫取食诱导的转基因烟草的挥发物，经分析并未检测到目的挥发物DMNT和TMTT，也未发现新的挥发物，我们推测这是因为烟草中缺少目的蛋白的催化底物导致的。当将整株烟草置于DMNT合成前体橙花叔醇的环境中，则检测到了DMNT的存在，但置于TMTT合成前体香叶基芳樟醇的环境中并未检测到TMTT的生成。这说明目的基因虽然在转基因烟草中过表达，但由于烟草中不存在萜烯同系物的代谢通路，缺少萜烯同系物合成的前体而无法生成萜烯同系物。未检测到TMTT的生成可能是由其他条件限制，可以将萜烯同系物前体的合成基因也转化至烟草进行进一步研究。通过病毒诱导的基因沉默技术目的基因GhCYP82Ls的表达量在沉默处理的棉花中下降约一半以上，色谱图中DMNT的峰面积也显著低于侵染空载体TRV2的对照组，说明目的基因被沉默后萜烯同系物DMNT的释放量受到显著影响。 4.参与萜烯同系物合成的TPS与CYP基因的共表达研究。首先，对已报道的体外酶活测定能生成橙花叔醇或香叶基芳樟醇的GhTPS22、GhTPS23、GhTPS24基因及直接生成DMNT和TMTT的GhCYP82L1、GhCYP82L2基因进行了组织表达谱分析，这两类基因均在被害虫取食诱导后的棉花地上组织中高表达。其次，通过真核表达使GhTPS22、GhTPS23、GhTPS24基因分别与GhCYP82L1、GhCYP82L2基因在酵母细胞中共表达，并以GhTPS22、GhTPS23、GhTPS24的催化底物FPP和GGPP为底物进行酶活测定，发现当以FPP为底物时GhTPS22+GhCYP82L1、GhTPS22+GhCYP82L2、GhTPS23+GhCYP82L1、GhTPS23+GhCYP82L2、GhTPS24+GhCYP82L1和GhTPS24+GhCYP82L2均能将其催化生成DMNT，当以GGPP为底物时GhTPS22+GhCYP82L1、GhTPS22+GhCYP82L2、GhTPS23+GhCYP82L1和GhTPS23+GhCYP82L2也能将其催化生成DMNT;然后，将GhTPS22、GhTPS23、GhTPS24基因分别与GhCYP82L1、GhCYP82L2基因构建到植物表达载体，转化至烟草进行共表达分析。共得到转pYLTAC380H，GhCYPL1,GhCYPL2,GhTPS22,GhTPS23,GhTPS24,GhTPS22+GhCYPL1,GhTPS22+GhCYPL2,GhTPS23+GhCYPL1,GhTPS23+GhCYPL2,GhTPS24+GhCYPL1和GhTPS24+GhCYPL2基因的12种烟草。在转基因烟草中目的基因均高表达。对转基因烟草的挥发物进行收集分析发现，仅转GhCYP82L基因的烟草仍无目标产物生成，而在转GhTPS22基因的烟草中检测到橙花叔醇释放，GhCYP82Ls与GhTPS22基因共表达的植株中则检测到了DMNT的生成。在转GhTPS24及GhCYP82Ls与GhTPS24基因的烟草中检测到芳樟醇生成。转GhTPS23，GhTPS23+GhCYPL1和GhTPS23+GhCYPL2基因的烟草挥发物需要进一步研究。这些结果表明在烟草中DMNT的生成由GhTPS22与GhCYP82Ls基因共同调控，为DMNT高释放的棉花品种研发奠定基础。