粘孢子虫蛋白酶抑制剂及蛋白酶的功能研究

摘要

粘孢子虫，为鱼类主要的寄生原生生物，给渔业的生产造成严重的危害。而目前粘孢子虫病的防治措施主要以化学试剂为主，不仅造成鱼体药物残留，而且还会引起水体污染。因此从分子机制阐明寄生虫如何入侵和感染宿主鱼，对于粘孢子虫的防治显得尤为重要。前期的吉陶单极虫组学研究突显出可分泌蛋白酶抑制剂和可分泌蛋白酶在营养代谢和组织入侵中的重要性。 本文在前期粘孢子虫吉陶单极虫转录组数据研究的基础上，从19个可分泌蛋白酶抑制剂基因中成功克隆并可溶性表达出1个可分泌半胱氨酸蛋白酶抑制剂TK Cystatin。TK Cystatin编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂，基因长度为363bp，编码120个氨基酸，理论等电点PI为6.97。ClusterW多序列比对发现TK Cystatin具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的保守位点，N端G19G20、Q73VVAG77、C端L102P1033个motif。通过进化树的构建，发现该蛋白与低等的腔肠动物水螅(Hydra vulgaris)cystatin-A类蛋白酶抑制剂的亲缘关系较近，进一步支持粘孢子虫属于刺胞动物门。通过荧光肽底物法检测TK Cystatin的活性研究发现，TK Cystatin对标准蛋白酶papain、cathepsinL、cathepsinB的均有抑制活性，TK Cystatin对papain、cathepsinL、cathepsinB的IC50分别为0.8μmol/L、0.175μmol/L及2.1μmol/L，对papain的抑制常数Ki为0.88μmol/L。TK Cystatin的抑制活性在20℃～47℃之间变化不大，表现出一定的温度稳定性。且发现TK Cystatin在碱性条件下时抑制活性较强。Pulldown实验分析，初步筛选出鲤鱼肠道中的前体组织蛋白酶L（CC precathepsinL）与TK Cystatin蛋白相互作用。将该基因去掉信号肽异源表达并纯化获得CC cathepsinL，但检测到CC cathepsinL蛋白酶活性较低。 进一步从34个可分泌蛋白酶基因中成功克隆并表达出3个可分泌蛋白酶基因:TK Papain-1、TK Papain-2和TK Pepsin。通过生物信息学的分析发现，TK Papain-1、TK Papain-2属于papain(C1A)家族成员，均编码半胱氨酸蛋白酶，分别编码150、322个氨基酸，蛋白大小17.06kDa、36.7kDa，理论等电点分别为9.30、7.75。TK Pepsin编码天冬氨酸蛋白酶，编码491个氨基酸，蛋白理论大小为55.41kDa，理论等电点6.37。3个蛋白均有信号肽序列，为可分泌蛋白;只有TK Papain-1分子内有二硫键。通过进化树的构建，发现与海葵、水螅、纤毛虫同源序列亲缘关系较近。由于这些蛋白均为不可溶性表达，限制了其性质与功能的研究。 本研究为进一步深入粘孢子虫蛋白酶抑制剂及蛋白酶功能及粘孢子虫与宿主的相互作用机制的研究提供基础。