中华绒螯蟹组织蛋白酶D和丝氨酸蛋白酶抑制剂3在螺原体感染过程中的功能研究

摘要

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹，是一种重要的经济蟹类，在我国淡水养殖产业中占有很大的比重。然而，近年来随着其养殖规模的扩大和集约化程度的不断提高，由细菌、病毒以及寄生虫等病原引起的各种疾病日益严重，给中华绒螯蟹养殖业的发展造成了巨大的经济损失，其中颤抖病是中华绒螯蟹中最严重的病害之一。王文等通过组织病理学的观察、细菌分离培养、分类地位的研究以及人工回感实验等证实颤抖病的病原是一种特殊的细菌——螺原体，并正式将它命名为中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasma eriocheiris）。前期研究表明，中华绒螯蟹螺原体主要通过河蟹的鳃或其体表进入河蟹体内，首先侵染其靶细胞——血细胞，再在血细胞中大量繁殖并随血液循环进一步侵染河蟹的神经和肌肉等组织，最终引起河蟹的颤抖病，进而导致河蟹死亡。因此鉴于中华绒螯蟹螺原体的特殊性以及对河蟹的致病性，对河蟹的免疫防御机制做进一步研究显得尤为重要。本硕士论文在前期研究的基础之上，通过基因克隆、生物信息学分析、蛋白原核表达、基因干扰，研究两种河蟹蛋白即组织蛋白酶D和丝氨酸蛋白酶抑制剂3(EscatD和Esserpin-3)在螺原体侵染河蟹的免疫反应机制中发挥的作用。本论文将为进一步探究螺原体在侵染过程中的河蟹免疫防御机理以及减少螺原体对河蟹养殖业的危害提供一定的理论依据。本论文研究结果主要包括以下三个方面:
　　1.EscatD基因克隆、生物信息学分析、蛋白原核表达以及相关功能的研究
　　以河蟹的血细胞cDNA为模板，通过PCR成功扩增了中华绒螯蟹组织蛋白酶D(EscatD)。该基因的cDNA全长序列为2748bp，其中5'非翻译区(UTR)140bp，3'UTR1450bp，开放阅读框1158bp，编码385个氨基酸，分子量约为41.66kDa，等电点为6.53。序列分析表明，EscatD蛋白由信号肽、前体域和成熟域3部分组成。同源性分析表明，EscatD的氨基酸序列高度保守，与水生甲壳类动物相似性在80％以上。进化分析表明，EscatD与虾类的亲缘关系比较近，与传统分类结果基本一致。构建了原核表达质粒pET-28a-EscatD，诱导表达获得了以包涵体形式存在的重组蛋白EscatD。组织表达结果发现，EscatD在被检测的所有器官中都有表达，其中在河蟹的眼柄、血细胞、肠和神经组织中表达量都相对较高，在心脏、肌肉和鳃中的表达量较少。上述结果为进一步开展EscatD的功能研究奠定重要基础。
　　2.EscatD免疫功能的初步研究
　　EscatD属于组织蛋白酶D家族的一员，近期的研究表明EscatD蛋白在甲壳动物的先天性免疫反应中发挥着重要的作用。qRT-PCR结果显示，在螺原体刺激河蟹血细胞后，EscatD mRNA的转录明显高于对照组（PBS组）。靶基因干扰后，EscatD下游基因JNK、ERK、P38和Relish的基因表达量均有所下降，螺原体感染河蟹的血细胞后，与阳性对照组相比螺原体的拷贝数明显增加，河蟹死亡率明显升高，进一步说明EscatD在河蟹应对螺原体的刺激中发挥着重要的免疫作用。
　　3.Esserpin-3免疫功能的初步研究
　　Esserpin-3属于丝氨酸蛋白酶抑制剂3家族的一员，近期的研究表明Esserpin-3蛋白在甲壳类的先天性免疫反应中发挥着重要的作用。qRT-PCR技术检测表明，螺原体刺激河蟹血细胞后，Esserpin-3mRNA的转录明显高于对照组（PBS组）。靶基因干扰后，Esserpin-3的上游基因LGBP的表达量升高，下游基因proPO的表达量升高;螺原体感染河蟹血细胞后，与阳性对照组相比螺原体的拷贝数减少，河蟹的死亡率明显降低，进一步说明Esserpin-3在河蟹应对螺原体的刺激中发挥着重要的免疫作用。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 螺原体的研究概况

1．1．1 中华绒螯蟹螺原体的发现和证实

1．2 螺原体侵染机制的研究

1．2．1 中华绒螯蟹螺原体侵染机理的研究

1．3 组织蛋白酶的研究进展

1．3．1 组织蛋白酶简介

1．3．2 组织蛋白酶的功能研究

1．3．3 组织蛋白酶D的研究进展

1．4 丝氨酸蛋白酶抑制剂3的研究进展

1．4．1 丝氨酸蛋白酶抑制剂3简介

1．4．2 丝氨酸蛋白酶抑制剂3的功能研究

1．5 本论文的研究目的、内容、意义和技术路线

第2章 中华绒螯蟹组织蛋白酶D的基因克隆、生物信息学分析及蛋白原核表达研究

2．1 材料方法

2．1．1 实验动物和细菌

2．1．2 主要实验器材及方法

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 EscatD部分基因的扩增

2．2．2 EscatD全长基因的扩增

2．2．2 序列特征分析

2．2．3 EscatD基因ORF序列扩增

2．2．4 EscatD基因ORF序列与pET-28a载体连接

2．2．5 重组质粒转化至克隆感受态细胞中

2．2．6 菌落PCR筛选阳性克隆及测序分析

2．2．7 重组质粒的原核表达

2．2．8 重组蛋白过柱纯化

2．2．9 BCA法测定蛋白浓度

2．2．10 qRT-PCR检测EscatD基因在河蟹各组织中的分布

2．3 实验结果

2．3．1 EscatD基因全长的扩增

2．3．2 EseatD基因序列特征分析

2．3．3 EscatD基因序列同源性分析

2．3．4 EscatD基因序列进化分析

2．3．5 EscatD基因克隆与原核表达载体的构建

2．3．6 重组蛋白的表达、纯化与鉴定

2．3．7 EscatD基因在不同组织中的表达

2．4 讨论

第3章 EscatD在螺原体感染过程中的作用研究

3．1 材料方法

3．1．1 主要设备

3．1．2 主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 qRT-PCR检测EseatD基因在S．eriocheiris刺激后的表达变化情况

3．2．2 EscatD双链RNA的合成及纯化

3．2．3 中华绒螯蟹EscatD基因干扰

3．2．4 EscatD基因下游4个基因的检测

3．2．5 EseatD基因干扰对于螺原体感染的影响

3．2．6 中华绒螯蟹死亡率统计

3．3 实验结果

3．3．1 qRT-PCR检测S．eriocheiris刺激后EscatD mRNA的表达变化

3．3．2 EscatD双链RNA的合成

3．3．3 EscatD基因干扰效果检测

3．3．4 EscatD基因干扰对下游基因的影响

3．3．5 EscatD基因干扰对螺原体侵染数量的影响

3．3．6 EseatD基因干扰后感染螺原体统计中华绒螯蟹的死亡率

3．4 讨论

第4章 Esserpin-3在螺原体感染过程中的作用研究

4．1 材料方法

4．1．1 主要设备

4．1．2 主要试剂

4．2 实验方法

4．3．2 Esserpin-3双链RNA的合成及纯化

4．3．3 Esserpin-3基因干扰效果检测

4．3．4 Esserpin-3基因干扰后，RT-PCR检测其上下游基因的变化

4．3．5 Esserpin-3基因干扰对螺原体侵染数量的影响

4．3．6 Esserpin-3基因干扰后感染螺原体统计中华绒螯蟹的死亡率

4．4 讨论

第5章 结论

5．3 中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶抑制剂3基因Esserpin-3在螺原体侵染过程中的作用研究

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢