大肠杆菌耐药性分析及ompF基因与Ⅰ类整合酶基因在生物被膜状态下表达相关性的研究

摘要

大肠埃希氏菌，又名大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)，属于革兰氏阴性菌，主要分为致病性和非致病性两类。随着抗生素在畜牧业的普遍应用和滥用，导致多重耐药甚至泛耐药大肠杆菌的产生和流行，致使大肠杆菌病的防控愈发困难。因此，通过开展大肠杆菌的耐药性调查，分析其与基因型、致病性和分子流行病学之间的关系，才能够选择更加合适有效的药物对大肠杆菌病进行预防与治疗。细菌耐药性的产生与多种蛋白相关，整合子作为一种重要的耐药基因捕获及传播元件，已经成为产生细菌耐药的主要机制之一，研究发现一些蛋白，如recA等可以通过应激反应影响Ⅰ类整合酶基因的表达，但外膜蛋白F(ompF)作为抗生素进入细菌内部的主要通道，它对大肠杆菌耐药基因的转移是否也有影响，目前尚无报道。 本研究从甘肃、青海两省的病料和粪便样品中分离到猪源，牦牛源，鸡源和犬源大肠杆菌各100株。MLST分型发现这400株大肠杆菌共有142个ST型（1STs/2.8株大肠杆菌），揭示该地区大肠杆菌流行菌株的复杂性。虽然不同动物源大肠杆菌的ST型不同，但均存在ST10（优势ST型）。eBURST分析将142个ST型分为19个克隆群(CCs)和67个单体，其中CC1，CC3，CC7，CC14和CC16克隆群属于潜在的致病群（B2/D群），其它属于非致病群（A/B1群)。B2/D群大肠杆菌在健康动物中的携带率为12.5％。耐药性检测发现，400株大肠杆菌共存在237个耐药表型，不同动物源大肠杆菌的耐药谱虽然不同，但所有动物源大肠杆菌对氨苄西林，四环素和强力霉素的耐药率均高于其它药物，对美罗培南和多粘菌素的耐药率均低于其它药物;伴侣动物（狗）和家畜（鸡和猪）对大多数抗生素的耐药率均在40％以上，而牦牛对15种抗生素的耐药率均低于40％;此外，伴侣动物（狗）和家畜（鸡和猪）的ESBL大肠杆菌分离株也远远多于牦牛，提示对伴侣动物和家畜要合理用药。 本研究通过耐药性检测，筛选出一株对本试验所选用的15种抗生素均敏感、且Ⅰ类整合酶基因阳性并能形成生物被膜的大肠杆菌N46(E.coli N46)进行基因敲除，研究其耐药性机理。通过Red同源重组，敲除E.coli N46的ompF基因，命名为E.coli N46/OmpF△;通过psTV28质粒成功构建回复株，命名为E.coli N46/OmpFcom。生长曲线检测发现ompF基因虽然不是大肠杆菌生长繁殖所必需的功能性基因，敲除后不会导致大肠杆菌的死亡，但会对大肠杆菌的生长有一定的影响。实时荧光定量PCR检测野生株，ompF基因缺失株和回复株的Ⅰ类整合酶基因在生物被膜状态下的表达情况，发现ompF基因缺失株Ⅰ类整合酶基因的表达水平比野生株明显降低，回复株Ⅰ类整合酶基因的表达水平有所升高，但不能回复到野生株的表达水平。初步确定在生物被膜状态下，ompF基因对大肠杆菌Ⅰ类整合酶基因的表达有影响。