犬瘟热病毒H蛋白与不同动物SLAM相互作用致细胞融合效率差异的分子机制

摘要

犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一种烈性、高度接触性传染病。犬瘟热病毒属于副粘病毒科、麻疹病毒属，是有囊膜的单股负链不分节段的RNA病毒，基因组从3'端到5'端依次编码6个结构蛋白，其中血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)分别与宿主细胞的细胞膜的结合和融合。病毒特异性受体在宿主细胞表面的表达是病毒侵入的首要条件，也是决定病毒组织嗜性和发病机理的重要因素。目前，CDV已知的两种主要细胞受体分别是:信号淋巴细胞激活分子(Signaling Lymphocyte Activation Molecules，SLAM)和细胞粘附分子-4(nectin-4)，这两种受体对CDV吸附侵入到宿主体内起重要作用。
　　SLAM为犬瘟热病毒感染宿主免疫细胞的受体，其与CDV H蛋白识别是病毒致病性的基础。不同动物SLAM可变区(V)氨基酸差异可影响受体与CDV H相互作用，进而可能导致宿主对CDV易感性的不同。我们前期研究结果表明水貂对CDV易感性低于貉，且同一株CDV在表达貉子SLAM受体的BHK细胞上比在表达水貂SLAM受体的细胞所引起的病毒效价高，进一步比对SLAM氨基酸序列结果显示水貂和貉SLAM-V区74和129位氨基酸存在V74I和R129Q突变，我们推测该2个位点氨基酸突变可能改变了CDV H蛋白与SLAM相互作用，并使其诱导的SLAM表达细胞膜融合效率的改变。本研究通过CDV H—SLAM V同源建模，SLAM蛋白74和129位氨基酸定点突变和表达分析及CDV H/F—SLAM细胞融合等实验，分别在三维结构、蛋白表达、H-SLAM相互作用等水平上开展研究。结果表明SLAM蛋白74和129位氨基酸均位于与CDV H作用界面;74、129位的氨基酸突变未明显改变水貂、貉SLAM蛋白的表达水平，SLAM-V74I突变降低了其蛋白表达但未影响其细胞融合能力，根据流式细胞检测结果显示，SLAM-V74I表达比例从95.6％下降至91.1％;水貂SLAM-R129Q突变后显著提高CDV对细胞的融合能力，体现在细胞融合实验中，其平均合胞体数目由23.9上升至32.07;而貉SLAM-Q129R突变则显著降低CDV对细胞的融合能力，其平均合胞体数目由19.4下降至15.8。该结果初步验证了我们的猜想，证实了水貂、貉74及129位氨基酸对细胞融合效率的影响。
　　其次，本研究以BHK-21细胞为亲本细胞，将pDisplay-mSLAM转染到细胞中，通过G418压力筛选并结合有限稀释法成功构建出稳定表达水貂SLAM的单克隆细胞系BMS，并利用细胞免疫荧光和RT-PCR技术对该细胞的稳定性进行鉴定，最终成功应用BMS细胞从疑似犬瘟热的水貂脏器中分离1株CDV野毒株，命名为ZCM(17)2。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 犬瘟热病毒概述

1．2 CDV结构蛋白

1．3 CDV受体

1．3．1 SLAM

1．3．2 nectin-4

1．3．3 其它受体

1．3．4 未知神经受体

1．4 CDV的跨宿主感染

1．4．1 SLAM和nectin-4受体在CDV致病性及跨宿主感染中的作用

1．4．2 其他因素

1．5 研究目的与意义

第二章 SLAM受体V区74、129位氨基酸替换对犬瘟热病毒致细胞融合的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 质粒、细胞株

2．1．2 主要试剂及设备

2．1．3 SLAM-V区蛋白三维结构的同源建模

2．1．4 SLAM突变体的构建及鉴定

2．1．5 BHK-21细胞转染

2．1．6 间接免疫荧光检测SLAM的表达

2．1．7 流式细胞术检测SLAM表达量

2．1．8 细胞融合实验

2．1．9 Hoechst33342核染色

2．1．10 平均合胞体数的计算及统计学分析

2．2 结果

2．2．1 SLAM蛋白三维结构

2．2．2 SLAM突变体的构建及鉴定

2．2．3 间接免疫荧光方法检测SLAM的表达

2．2．4 流式细胞术定量SLAM表达量

2．2．5 细胞融合及其Hoechst33342核染色结果

2．2．6 平均合胞体数的计算及统计学分析结果

2．3 讨论

2．4 本章小结

第三章 稳定表达水貂SLAM受体BHK-21细胞系的建立及初步应用

3．1 材料与方法

3．1．1 病料、毒株

3．1．2 细胞、质粒

3．1．3 主要试剂及设备

3．1．4 G418最适浓度的确定

3．1．5 稳定表达mSLAM的BHK-21单克隆细胞系的建立

3．1．6 mSLAM基因转录及蛋白表达检测

3．1．7 CDV强毒株在BMS细胞中生长情况

3．1．8 CDV流行毒株的分离及鉴定

3．2 结果与分析

3．2．1 BMS细胞中mSLAM基因的转录及蛋白表达检测

3．2．2 CDV强毒株在BMS细胞中生长情况

3．2．3 CDV分离株的鉴定

3．3 讨论

3．4 本章小结

第四章 全文总结

参考文献

附录

致谢

作者简历