磷在正常与相关基因沉默的原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的转运吸收研究

摘要

在本实验室前期肉鸡全体内自然饲喂试验和体外原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞试验研究磷吸收成果的基础上，本论文通过如下三个试验，进一步研究磷在正常与相关磷转运载体基因沉默的原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的转运吸收及相关磷转运载体的基因表达，以初步揭示肉鸡十二指肠磷吸收的分子机制。 试验一 研究不同磷浓度下原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的磷吸收及相关磷转运载体的基因表达。采用单因子完全随机设计，设0、0.5、1.0、2.0和4.0mmol/L共5个不同磷浓度孵育水平处理组，每个处理组6个重复，孵育时间为87min(由本实验室前期体外细胞试验结果确定)。结果表明，不同磷孵育水平对十二指肠上皮细胞磷吸收率有显著影响(P＜0.05)，十二指肠上皮细胞磷吸收率随着磷孵育水平的增加而增加;与对照组相比，磷孵育水平为4mmol/L时显著降低了Ⅱb型钠磷协同转运载体(TypeⅡb Sodium-Phosphate Cotransporter，NaP-Ⅱb)和无机磷转运载体1(Inorganic Phosphate Transporter1，PiT-1)mRNA表达水平(P＜0.05)，而磷孵育水平为0.5和2mmol/L时，NaP-Ⅱb、PiT-1和PiT-2mRNA表达水平没有显著变化(P＞0.05);磷孵育水平对NaP-Ⅱb、PiT-1和PiT-2蛋白表达水平均无显著影响(P＞0.05)。上述结果表明，以上磷孵育水平(0.5-4mmol/L)对磷转运载体的表达均偏高，故在下面的试验三中需进一步降低磷孵育水平。 试验二 分别研究不同siRNA序列对NaP-Ⅱb和PiT-2(由本实验室前期全体内肉鸡试验结果确定)的沉默效率，以筛选获得沉默效率最高的siRNA序列。筛选NaP-Ⅱb或PiT-2siRNA试验均采用完全随机试验设计。筛选NaP-Ⅱb-siRNA试验共设4个处理组，即空白对照组(未转染siRNA)、阴性对照组(转染阴性siRNA)及2个NaP-Ⅱb-siRNA处理组(转染NaP-Ⅱb-siRNA1372和1416)，每个处理组3个重复;筛选PiT-2-siRNA试验共设5个处理组，即空白对照组(未转染siRNA)、阴性对照组(转染阴性siRNA)及3个PiT-2-siRNA处理组(转染PiT-2-siRNA890、996和1217)，每个处理组3个重复。结果表明，与空白对照和阴性对照组比，两个转染NaP-Ⅱb-siRNA处理组均在mRNA水平上降低了NaP-Ⅱb的表达，降低水平约为65％，但没有显著差异(P＞0.10);在蛋白表达水平上也无显著差异(P＞0.10)，但转染NaP-Ⅱb-siRNA1372的蛋白表达量更低。3个转染PiT-2-siRNA处理组中，PiT-2-siRNA890显著降低了PiT-2mRNA表达水平(P＜0.10)，降低水平约为80％，在蛋白表达水平上无显著差异(P＞0.10);另外两个PiT-2-siRNA处理组在mRNA和蛋白表达水平上均没有显著差异(P＞0.10)。因此，选择NaP-Ⅱb-siRNA1372和PiT-2-siRNA890进行以下试验三研究。 试验三 采用siRNA干扰技术，研究磷在正常与NaP-Ⅱb和PiT-2表达分别沉默的原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的转运吸收，以揭示NaP-Ⅱb和PiT-2是否直接参与了肉鸡十二指肠上皮细胞磷的转运吸收。NaP-Ⅱb和PiT-2基因沉默试验均采用2×2两因子完全随机试验设计。2个siRNA处理组分别为:转染NaP-Ⅱb-siRNA1372或PiT-2-siRNA890处理组及空白对照组，2个磷孵育水平分别为0和0.25mmol/L。每个处理组设3个重复。结果表明，磷孵育水平对原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞NaP-Ⅱb mRNA和蛋白表达水平均无显著影响(P＞0.10)，但siRNA1372特异性沉默NaP-Ⅱb基因后显著降低了其NaP-Ⅱb mRNA的表达(P＜0.10)，而对其蛋白表达水平无显著影响(P＞0.10)。磷孵育水平与是否转染siRNA的互作对原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞磷吸收率有显著影响(P＜0.10)。在0.25mmol/L磷孵育水平下，与空白对照组相比，siRNA1372转染组显著降低了十二指肠上皮细胞的磷吸收率。以上结果表明，由于siRNA特异性抑制了原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞NaP-Ⅱb mRNA的表达，进而降低了细胞对磷的吸收。磷孵育水平显著提高了原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞PiT-2蛋白表达水平及磷吸收率(P＜0.10)。siRNA890特异性沉默PiT-2基因对PiT-2蛋白表达水平及磷吸收率无显著影响(P＞0.10)。磷孵育水平与是否转染siRNA的互作对PiT-2mRNA表达有显著影响(P＜0.10)。在0.25mmol/L磷孵育水平下，与空白对照组相比，siRNA890转染组显著降低了PiT-2mRNA表达水平(P＜0.10)。以上结果表明，抑制原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞PiT-2mRNA表达并不影响细胞对磷的吸收。 综上所述，NaP-Ⅱb可能直接参与了原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞磷的转运吸收，而PiT-2可能并未参与其磷的转运吸收。