伪狂犬病毒不同毒株间gC蛋白的抗原差异性研究

摘要

伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种对养猪业危害极大的传染病。2011年下半年，PRV变异株在我国免疫猪群中开始流行。本实验室率先分离到变异株，命名为HeN1株。研究表明接种现有疫苗株不能使易感动物获得对变异株的完全保护，血清中和试验显示疫苗株Bartha-K61与HeN1株之间存在明显的抗原差异。gC蛋白是PRV重要的中和性抗原，其变异可能会导致疫苗株免疫猪体后产生的中和抗体不能对PRV变异株进行有效的中和。因此我们利用酵母表面展示技术获取疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1gC蛋白的抗原区，来探究毒株间的抗原性差异。
　　为了解PRV变异株的流行及变异情况，2016～2017年间，对来自安徽、河北、山东等省份的大中型猪场送检的疑似PRV病料进行PCR检测，鉴定出16份PRV阳性病料，对其gC、gE基因进行序列分析，两者氨基酸序列与2012年以来的变异株的相应氨基酸序列同源性分别为982％～100％与993～100％，与经典株的相应氨基酸序列同源性相对较低，分别为925％～948％与953‰991％。变异株的gE蛋白均在第48位和第492位各插入1个天冬氨酸，在gC蛋白的64～70位处连续插入7个氨基酸，分离株具有与变异株相同的分子标记，并且分离的16株PRV与GenBank下载的近年来国内报道的PRV变异毒株在系统进化树上处于同一分支，与经典株位于不同分支，表明HeN1株仍是目前PRV流行毒株的代表毒株。
　　本研究利用DNaseⅠ将疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1的gC基因随机酶切成100～250bp的小片段，然后连接到酵母展示载体pCTCON2中，将连接产物电转入大肠杆菌DH5α中构建随机的酵母展示文库。提取两个文库的质粒并电转入制备的酿酒酵母EBY-100感受态中进行培养诱导。用抗B artha-K61与抗HeN1株的猪阳性血清分别对两个诱导表达后的酵母文库进行染色，通过流式细胞仪对阳性酵母进行经两轮分选富集，提取富集后阳性酵母的质粒进行测序分析，通过分析克隆的分布及个数来绘制抗原区图谱。结果显示，HeN1-gC蛋白的主要抗原区位于A1区(23-152位aa)、次要抗原区位于A3区(337-487位aa)、非抗原区位于A2区(153-336位aa)，Bartha-K61-gC蛋白的主要抗原区位于B1区（23-130位aa）、次要抗原区位于B2区(131-222位aa)、非抗原区位于B3区(223-480位aa)。
　　将两毒株gC蛋白的各抗原区片段进行酵母展示表达与原核表达，进行流式分析与ELISA分析，结果验证了两毒株gC蛋白的各抗原区的抗原特性，抗原区与血清交叉分析表明两毒株gC蛋白的主抗原区的抗原性差异不大，次要抗原区的抗原性存在差异，非抗原区与血清交叉分析存在一定的抗原性，本研究推测PRV两毒株gC蛋白之间的抗原差异性可能与氨基酸的同源性关系较小，而与病毒自身的调控有关。
　　综上所述，本研究利用酵母展示技术将构建的疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1的gC蛋白抗原文库展示于酵母表面，筛选并鉴定了两毒株gC蛋白的主抗原区与次抗原区，以上研究为揭示PRV毒株间的变异及免疫逃避的机制提供基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1 猪伪狂犬病

1．2．1 伪狂犬病病毒的结构

1．2．2 致病机理

1．2．3 gC蛋白的功能及表位研究进展

1．3 酵母展示技术

1．3．1 酵母表面展示的原理

1．3．2 酵母展示技术分选抗原的原理

1．3．3 酵母表面展示技术应用

1．4 本研究的目的和意义

第二章 猪伪狂犬病流行病学调查

2．1 材料与方法

2．1．1 病料样品、主要试剂及仪器

2．1．2 引物设计

2．1．3 组织研磨及DNA提取

2．1．4 PCR鉴定

2．1．5 gC、gE基因序列分析

2．2 结果

2．2．1 病料检测

2．2．2 PRV gC、gE基因序列分析

2．3 讨论

第三章 两株PRVgC蛋白酵母文库的构建与筛选

3．1 材料

3．1．1 毒株、质粒及血清

3．1．2 主要试剂及仪器

3．1．3 主要试剂配制

3．2 方法

3．2．2 两毒株gC蛋白酵母随机文库的构建

3．2．3 两毒株gC蛋白酵母展示文库质量的鉴定

3．2．4 两毒株gC蛋白酵母表达文库的筛选

3．3 结果

3．3．2 两毒株gC蛋白酵母展示文库的构建

3．3．3 两毒株阳性血清的特异性分析

3．3．5 两毒株gC蛋白文库分选结果的鉴定与分析

3．4 讨论

第四章 两毒株gC蛋白抗原区的抗原特性研究

4．1 材料

4．1．1 主要试剂及仪器

4．1．2 主要试剂配制

4．2 方法

4．2．2 两毒株gC蛋白各抗原区的流式分析

4．2．3 两毒株gC蛋白各抗原区原核表达重组质粒的构建

4．2．4 两毒株gC蛋白各抗原区抗原特性的ELISA分析

4．3 结果

4．3．1 两毒株gC蛋白各抗原区酵母展示重组质粒的构建与鉴定

4．3．2 两毒株gC蛋白各抗原区的流式分析

4．3．3 两毒株gC蛋白各抗原区原核表达重组质粒的构建

4．3．4 两毒株gC蛋白各抗原区的抗原特性的ELISA分析

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介