棉花DNA甲基转移酶基因家族鉴定及抗逆功能分析

摘要

DNA甲基化是一种重要表观遗传修饰，涉及到自身的基因沉默、转座子原件抑制、X染色体失活、细胞分化、维持胚胎发育等过程。DNA序列发生甲基化过程中，需要含有DNA-methylase结构域的DNA甲基转移酶催化完成，并且发现DNA甲基转移酶参与植物的非生物胁迫，棉花中还没有系统的研究。为探究棉花DNA甲基转移酶响应非生物胁迫的反应机制，挖掘棉花的抗逆基因。本研究从二倍体和四倍棉花的基因组共鉴定出了51个DNA甲基转移酶家族基因，分析了51个家族成员之间的进化关系。克隆陆地棉GhDMT6和GhDMT9基因，构建其沉默载体、过表达载体，初步验证GhDMT6和GhDMT9基因的功能。主要研究结果如下: 1.以DNA-methylase结构域（PF00145，IPR001525）为参考序列，从亚洲棉(A2)、雷蒙德氏棉(D5)、陆地棉（AD1）、海岛棉（AD2）基因组中鉴定出51个DNA甲基转移酶家族成员。其中A2组有9个、D5组8个、AD1组有16个、AD2组有18个基因。亚细胞定位预测显示，大多数DNA甲基转移酶位于细胞质，其中一些位于细胞质膜，而GbDMT13预测位置是在细胞周质。 2.棉花中的DNA甲基转移酶基因分为CMT、MET、DRM、DNMT2四种类型;该分组与基因自身的蛋白结构域差异、基因结构差异一致。A2、D5、AD1和AD2组中DNA甲基转移酶家族基因的进化关系与单个基因组内进化关系相同。DNMT2家族基因在真菌、动物、植物中都被鉴定出同源基因，结构比较保守。 3.实时定量PCR分析结果表明:DNA甲基转移酶基因的表达受到棉花品种、胁迫条件、组织部位、胁迫时间等条件影响，基因表达模式的随着条件改变而发生变化。亚洲棉（石系亚1号）号和雷蒙德氏棉受到胁迫后，DNA甲基转移酶下调基因分布在根茎部位较多，叶片上调基因较多;陆地棉(TM-1)与二倍体棉不同在根茎中分布上调基因较多，叶片下调基因较多。 4.克隆了陆地棉GhDMT6、GhDMT9基因。干旱、盐胁迫时，GhDMT6基因表达量上调。棉花幼苗被沉默GhDMT6后对盐、干旱胁迫时抗性增强。过表达GhDMT6的拟南芥幼苗抗性增强。通过构建基因敲除载体转化棉花，获得2株阳性植株。干旱、盐胁迫时，GhDMT9表达量上调。TM-1棉花幼苗VIGS沉默GhDMT9后，沉默植株抗干旱、盐胁迫能力减弱。转GhDMT9基因转化的拟南芥幼苗对干旱、盐胁迫更加敏感。 通过对棉花DNA甲基转移酶家族基因的研究，结合基因表达分析，基因功能验证结果，发现DNA甲基转移酶在棉花响应胁迫过程中发挥重要作用，为进一步研究棉花的抗逆机制，挖掘功能基因奠定基础。