毛皮兽阿留申病毒交叉引物等温检测方法的建立与流行病学调查

摘要

为防制毛皮兽（貂、狐和貉）感染阿留申病毒，本研究以阿留申病毒属内病毒序列为参考设计引物，建立了可定量检测和分型病毒的毛皮兽阿留申病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)和适宜现场应用的毛皮兽阿留申病毒可视化交叉引物等温检测方法(cross-priming isothermal amplification，CPA)。结果显示，qPCR和CPA可视化检测都具有较好的敏感性和特异性，检测AMDV和RFAV最低浓度分别为5.38×102copies/μL和5.93×102copies/μL。qPCR是一种高敏感性、特异性检测毛皮兽阿留申病毒的检测方法，并可通过实测Tm值区分阿留申病毒;CPA是一种高敏感性、特异性检测毛皮兽阿留申病毒，通过添加荧光染料实现可视化检测，可提供一种更加适合基层兽医站、养殖场的快速核酸检测方法。 为调查中国辽宁和吉林省水貂、乌苏里貉和蓝狐阿留申病毒感染情况。本研究运用碘凝集(Iodine agglutination test，IAT)、对流免疫电泳(Counter immuno-electrophoresis，CIEP)和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)方法或技术对辽宁和吉林省的8个养殖场共5135样品进行检测。结果表明，8个养殖场，水貂和乌苏里貉感染阿留申病毒较为严重。在对辽宁省某2个养殖场全检发现，不同感染率貂场水貂感染AMDV后疾病进程不同。进一步分析表明，低感染率貂场中IAT-CIEP-貂群比例最高，但貂群中存在感染早期貂，qPCR结果显示，连续检疫淘汰的AMDV低感染率貂场水貂相比较高感染率貂场更为敏感，AMDV在水貂体内拷贝数比高感染率貂场高2个数量级（100倍）;相比之下，高感染率貂场中CIEP+水貂虽高达98％，但IAT-CIEP+貂群占41％，表明貂群中存在AMDV耐受貂和抗性貂。PCR检测进一步证明，貂群中具有其它潜在发展为耐受貂和抗性貂群体。建议通过IAT、CIEP和PCR联合检疫逐年筛选AMDV抗性貂和耐受貂。 对8个养殖场部分PCR阳性样品VP2高变区测序进行系统发育学分析。进化树显示，AMDV可大致分为5组(Ⅰ-Ⅴ)，RFAV自成1组(Ⅵ)。辽宁、吉林2省貂场主要集中在Ⅰ组，同组参考序列为AMDV-Harbin和AMDV-Beijing，而JZ-SD-32和LZ-ZCSD1-B分别属于Ⅱ组和Ⅴ组。并且AMDV与RFAV在自然感染状态下，未发现交叉感染。总之，本研究对2省8个养殖场进行流行病学调查，并通过联合检疫调查不同感染率貂场AMDV感染状态特征，为中国AMDV和RFAV的流行特征以及养殖场引种、检疫、淘汰提供理论依据。