2个棉花抗黄萎病相关基因的克隆及功能分析

摘要

棉花是我国重要的经济作物之一，是天然纤维和棉籽油的重要来源。近年来，黄萎病已经成为棉花生产中最具毁灭性的病害，对棉花产量和纤维品质构成严重威胁。利用分子生物学和基因工程的方法，挖掘抗病相关基因，为棉花抗病育种提供了新途径。本研究基于课题组构建的黄萎病诱导的转录组数据库，从中筛选出与棉花抗黄萎病相关的2个差异表达基因。通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)、转基因等手段验证其在植物抗黄萎病中的功能，为棉花抗病育种提供帮助。 利用同源克隆的方法，从海岛棉海7124中克隆了GbVIP1基因。测序结果表明该基因ORF序列全长1014bp，编码337个氨基酸，是一种亲水性不稳定蛋白质。生物信息学分析显示GbVIP1蛋白包含保守的bZIP结构域，是一个bZIP转录因子。组织表达特异性分析表明VIP1基因在棉花根部组织的表达量最高。对不同棉花材料接菌处理，发现抗病棉花材料中的VIP1基因显著上调表达。利用激素喷洒处理棉花叶片，结果显示V1P1基因受外源激素ET的诱导显著上调表达，这说明GbVTP1基因的表达可能与ET有关。 利用VIGS技术在棉花中沉默GbVIP1基因，用黄萎病菌处理植株后，沉默目的基因的棉花叶片显病症，而对照植株比较健康。通过基因表达量检测、病情指数统计、病原菌再分离、台盼蓝染色、根部纵剖等实验，进一步证实了沉默GbVIP1基因植株比对照植株更易感病，表明GbVIP1基因在棉花抗黄萎病过程中发挥重要作用。 利用植物组织培养技术培育转GbVIP1基因的烟草，发现转基因烟草植株比野生型植株更抗黄萎病，这与VIGS实验结果一致。对转GbVIP1基因烟草植株中的抗病相关基因进行表达量检测，结果表明PR1、PR1-like、HSP70基因在受黄萎病菌诱导后显著上调表达，推测PR1、PR1-like、HSP70基因的上调表达提高了植株对黄萎病的抗性。 从海岛棉海7124中克隆了棉花GbNOT2b基因，该基因ORF序列全长1839bp，编码612个氨基酸;GbNOT2b蛋白属于亲水性不稳定蛋白，有73个潜在的磷酸化位点。结构分析表明该基因含保守的NOT结构域，属于NOT2_3_5类型。利用qRT-PCR发现该基因在受黄萎病菌诱导的抗病材料中表达量升高，外源激素SA、ET处理棉花叶片也会诱导该基因显著表达。利用VIGS技术将棉花中GbNOT2b基因沉默，降低了棉花对黄萎病的抗性，为后续转基因植株的功能验证提供参考。