泛素蛋白酶体系统在传染性支气管炎病毒复制周期中的功能性研究

摘要

禽传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis，IB）是禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病。IBV属于冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）的γ型冠状病毒，病毒颗粒外包囊膜，内含不分节段的单股正链RNA基因组。泛素蛋白酶体系统简称为UPS(Ubiquitin-Proteasome System)，能够降解错误折叠或受损的蛋白质，从而维持细胞内的蛋白质稳态，同时在细胞周期调控、信号转导、转录调控、细胞凋亡、抗原递呈等许多细胞生理活动中起着关键的作用。目前有不少报道表明病毒的感染依赖于UPS，包括MHV等冠状病毒。然而，UPS对IBV增殖的影响，尚不清楚。本研究以Vero细胞、H1299细胞、和鸡胚胎成纤维细胞DF-1为细胞模型，采用多种方法研究UPS对IBV感染和增殖的作用。 一、抑制UPS系统，不利于IBV的感染和增殖 IBV感染Vero、H1299、或DF-1细胞，在不同的感染时间点，分别加入蛋白酶体抑制剂MG132、Epoxomicin或Bortezomib，感染后12小时收样，通过Western blot检测病毒蛋白N的表达，并通过荧光定量RT-PCR检测病毒基因组，探讨UPS对病毒增殖的影响。结果表明，在感染后0到6小时加入UPS抑制剂，明显降低病毒蛋白的表达和病毒基因组RNA的水平。之后，将UPS抑制剂处理细胞的时间点精细化，发现抑制剂主要在感染后0到2小时抑制IBV入侵。以猪传染性腹泻病毒PEDV感染Vero细胞，同样发现，在感染后0到2小时加入UPS抑制剂，显著降低病毒的入侵和增殖。以上结果表明，UPS可能在病毒的入侵阶段发挥作用。 二、UPS在IBV内吞后和基因组起始翻译之前发挥作用 接下来，探讨UPS在病毒入侵的哪个阶段发挥作用。IBV的入侵包括吸附、内吞、胞内运输、膜融合、和脱壳。完成脱壳后，以病毒基因组RNA为模板，翻译病毒的开放读码框架(Open Reading Frame，ORF)1a和1ab，合成病毒复制所需要的酶，再对病毒基因组进行复制。在感染后2小时检测内吞的病毒基因组，发现UPS抑制剂并不干扰细胞对病毒的内吞。在感染后5小时检测病毒ORF1a和ORF1ab的翻译，发现UPS抑制剂处理显著降低ORF1a和ORF1ab的翻译。通过嘌呤霉素标记实验，检测细胞内蛋白的合成效率，结果表明UPS抑制剂处理2个小时，并没有显著影响细胞的蛋白翻译效率。因此，ORF1a和ORF1ab的翻译减少，并非由于蛋白翻译效率下降导致。内吞的病毒没有减少，而起始翻译出来的蛋白显著降低，说明UPS抑制剂在病毒内吞之后和基因组复制之前发挥作用，极有可能作用于病毒的胞内运输、膜融合、或脱壳等步骤。 三、IBV入胞需要相关蛋白泛素化修饰 进一步研究发现，UPS抑制剂处理细胞后，细胞内游离的泛素蛋白单体明显减少，泛素化修饰的蛋白明显增多，说明UPS抑制剂可能通过阻止蛋白降解和泛素蛋白单体的循环利用，耗尽泛素蛋白单体，进而影响相关蛋白的泛素化修饰及其功能，从而影响病毒的感染效率。采用泛素蛋白激活酶E1抑制剂PYR-41处理细胞，抑制相关蛋白的泛素化，发现在IBV感染后0-2小时加入PYR-41，明显降低病毒的增殖，证实了相关蛋白泛素化修饰对病毒入胞的必要性。