蜜蜂球囊菌转录组分析及其致病相关基因挖掘与鉴定

摘要

蜜蜂白垩病是由蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）引起的昆虫真菌性病害，一旦发病对蜂业生产造成巨大损失。我们在以往的实验中，我们采用限制性内切酶介导的基因整合技术（REMI），获得了多个蜜蜂球囊菌(A.apis)突变体，并通过蜂群接种和实验室人工饲喂幼虫接种病原球囊菌孢子的方法，已经筛选出与野生型球囊菌存在着较大的致病性差异的突变株，然而目前未止，对球囊菌致病性差异的机理尚未明确。为了深入研究蜜蜂球囊菌的致病机理，我们在前期已经获得的稳定遗传的球囊菌突变体的基础上，采用转录组测序方法，对致病性不同的3株蜜蜂球囊菌及野生型初始菌的转录组进行了测序，对球囊菌致病相关基因进行了分析，初步探讨了蜜蜂球囊菌致病性的分子机理。主要研究结果如下。 1.采用Illumina测序技术，对及野生型初发菌WT和前期采用REMI突变技术获得的3株致病性不同的球囊菌突变体M1、M4、M7进行了转录组de novo测序，对序列进行了组装和注释。结果表明，所测定的野生型菌株WT以及3株弱致病性突变体菌株M1、M4、M7及共产生了394，910，604reads，获得了12，989unigene，N50为853bp。BLASTx搜索结果表明，9，598个基因可以被注释为已知基因(UniProt库，E-value≤1.0E-05)，7,807个基因可以得到有效注释（Interpro库）。对6，583进行了Gene Ontology(GO)分析，其中2，521个基因可以分为三大类。蛋白质家庭数据库搜索结果发现，6，561个基因与已知蛋白相似，其中230个蛋白有效进行了COG分类和注释。另外，KEGG富集结果表明，2503个基因有效富集到314个通路，其中发现了356个真菌特异转录因子(TF)，而这些转录因子可以分在32个蛋白家族，预示着这些基因在蜜蜂球囊菌致病过程中具有重要的作用。 2.对蜜蜂球囊菌3个致病性变异突变体与野生型菌株进行了差异表达基因(DEGs)分析。结果表明，在全部的172，3，996个DEG中有650个基因上调表达，同野生型相比，M1，M4,M7分别有4,403，2，845和3，016个基因下调表达。挖掘出大量在不同处理间出现表达差异的致病性相关基因，而这些基因也正是在弱致病性的突变体中下调表达的基因。同WT野生型相比，在3个突变体中有53个水解酶基因、54个转录因子，25个细胞壁合成降解相关基因，分别在M1、M7和M4中下调表达，且M1、M7下调表达的程度大于M4。研究表明，在水解酶作用下，致病菌可有效地完成对宿主细胞的侵入和逃逸过程，是一类重要的致病相关蛋白。转录起始因子也一是类重要的致病相关蛋白，在转录调控上对致病菌的致病性发生作用。细胞壁合成与降解相关基因对细胞的形态结构起着十分重要的作用，通过这些基因与宿主细胞的相互作用，可以有效保护细胞免受环境压力，在外界环境胁迫下，可保护宿主细胞结构不发生变化，细胞形态不发生改变。采用qRT-PCR方法对3个突变体中的12个下调基因进行验证，验证结果与测序结果完全一致。 3.对蜜蜂球囊菌3个突变体与野生型菌株的差异表达基因进行了GO富集和KEGG富集。结果表明，同野生型相比，M1、M4、M7分别有811，691和660个基因有效GO富集，筛选出了一些与致病性密切相关的基因。KEGG途径富集分析显示，与野生型相比，在三个突变体中共富集到9个途径中的216个基因被下调。其中，已知的5种涉及真菌致病性的途径通过随机突变被抑制（M1突变体含有3种，M7突变体含有2种）。同野生型相比，甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢通路(28基因)以及aminoacyl-tRNA合成通路(31基因)是在M1中特异表达的通路。另外，M1与M4相比，真核生物核糖体生物合成通路这一通路中有54个基因下调表达。与野生型相比，M7中Fatty acid metabolism通路(17genes)下调表达。与M4相比，M7中基部转运因子通路中有21个基因下调表达。 4.研究发现，在蜜蜂球囊菌3个突变体巾，M1和M7的致病性要小于M4，而3个突变体的致病性均小于野生型球囊菌，转录组KEGG富集分析和GO富集数据分析结果与体外接种实验的结果相一致，相关基因的差异表达也与体外接种实验结果相一致。 综上所述，本研究对球囊菌致病性不同的突变体及野生型菌株的转录组进行了分析，筛选出与蜜蜂球囊菌致病性相关基因并进行了验证，对蜜蜂球囊菌致病性分子机理进行了初步探讨。研究结果为今后进一步开展蜜蜂球囊菌致病基因功能奠定了基础，对有效防控蜜蜂白垩病具有重要意义。