日本血吸虫Sjp38MAPK基因编码cDNA的克隆、重组蛋白表达及其功能研究

摘要

血吸虫需要雌雄虫配对和合抱以完成其发育成熟和产卵，并且成熟后血吸虫所产的产卵是造成宿主病理损伤的主要原因。因此，揭示参与血吸虫生殖发育相关的信号调控通路对开发新的防控策略具有重要意义。实验室前期通过磷酸化蛋白质组学研究发现Sjp38MAPK在日本血吸虫信号通路网络中是关键节点之一，为了阐明Sjp38MAPK在日本血吸虫的寄生和生殖发育过程中的作用，本研究对日本血吸虫Sjp38MAPK基因编码的cDNA进行了克隆，并对重组蛋白进行了表达及鉴定。另外，还对Sjp38MAPK在日本血吸虫不同发育阶段、雌雄虫的转录水平进行了分析。利用RNA干扰技术，抑制了Sjp38MAPK基因的转录，对Sjp38MAPK在日本血吸虫的生殖和发育中的功能进行了初步研究。 具体包括以下三个内容: （一）日本血吸虫Sjp38MAPK基因编码cDNA的克隆表达及生物信息学分析 根据实验室前期蛋白质组学鉴定的Sjp38MAPK,设计引物，进行PCR扩增，序列分析表明该基因序列包含一个1038bp的开放阅读框，编码Sjp38MAPK蛋白，预测分子量为39.58kD。生物信息学分析表明Sjp38MAPK序列与曼氏血吸虫的同源性为93.48％，与埃及血吸虫的同源性为90.70％，与人和小家鼠的同源性均为57.10％。另外，还构建了原核重组质粒pET-32a(+)-Sjp38MAPK，成功诱导表达，并获得重组蛋白rSjp38MAPK，并用MALDI-TOF-TOF对重组蛋白进行了鉴定。 （二）Sj38MAPK在日本血吸虫不同发育时期和性别中的转录分析 通过RT-qPCR方法检测Sjp38MAPK在日本血吸虫不同发育时期（虫卵、尾蚴和感染后第14d、21d、28d和35d）和雌雄虫（感染后14d、21d、28d和35d）中Sjp38MAPK的转录水平。结果显示，Sjp38MAPK在日本血吸虫尾蚴、虫卵、童虫和成虫时期均有表达，并且在成虫(21d、28d、35d)中的表达量显著高于虫卵、尾蚴和童虫时期。另外，在28d和35d时，Sjp38MAPK在雄虫中的表达显著高于雌性，表明Sjp38MAPK的转录具有发育时期和性别的差异性。 （三）日本血吸虫Sjp38MAPK的体外干扰 利用电转的方法对日本血吸虫的Sjp38MAPK基因进行体外干扰，在转录水平上对干扰效果进行了分析，筛选出具有最佳干扰效果的小RNA分子(siRNA-977)。用Hoechst33258荧光染料对干扰Sjp38MAPK后的血吸虫进行染色，观察并统计虫体活性。还用CellTiter-LumiTM法测定虫体细胞活性。此外，还利用RT-qPCR分析了干扰Sjp38MAPK后，日本血吸虫4种卵壳蛋白基因的mRNA表达水平。结果表明Sjp38MAPK干扰后，日本血吸虫虫体活性下降，死亡率增加;卵壳蛋白基因AY222895.1，M59318.1和D32205.1的转录水平显著降低，提示Sjp38MAPK可能在血吸虫生存和生长发育中发挥着重要的调控作用。